閆麗紅 楊利軍 楊 濤*

（1 山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山西 太原030001；2 山西醫(yī)科大學藥理學教研室，山西 太原030001）

結直腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，近年來在我國大城市發(fā)病率和病死率逐年攀升。在結腸癌患者發(fā)生遠處轉移的患者中，5年存活率只有10%[1]，其在常發(fā)腫瘤中排名第3。因此，對結腸癌發(fā)生發(fā)展與發(fā)病機制的深入研究具有重要意義。剪接因子SRSF7（也稱9G8）是一個可以穿梭于細胞核和細胞質之間的SR蛋白家族成員[2]，有研究報道核質穿梭的SRSF7蛋白可通過與介導mRNA出核的NXF1/TAP（mRNA核蛋白輸出因子/異常糖鏈糖蛋白）蛋白相互作用，從而調控mRNA出核[3]，調節(jié)SRSF7蛋白的轉錄，促進腫瘤細胞的增殖。有研究報道SRSF7的敲低可以抑制HCT116增殖而促進凋亡[4]。目前有關SRSF7在動物水平的研究尚不明確，因此，本研究將進一步在動物水平探究SRSF7在結直腸癌生長過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料：本實驗中使用的細胞株HCT116由中國科學院上海細胞庫提供。BABL/c雄性裸鼠，鼠齡4~5周，體質量18~20 g，共計10只，購自北京維通利華有限公司，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學實驗動物中心，為SPF級環(huán)境。本實驗用McCoy's 5A培養(yǎng)基購自Sangon公司，胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液和青鏈霉素混合物購自Solarbio公司。Ki-67單克隆抗體和cleaved Caspase-3多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物PV-6000購自中杉金橋生物公司，PCR相關試劑均購自TaKaRa公司，SRSF7 shRNA病毒由吉凱基因公司合成。

1.2 實驗方法

1.21 慢病毒載體的構建：設計srsf7 shRNA干擾靶點序列（5'-AGGAG AGUUAGAAAGGGCU-3'）并在兩端添加限制性核酸內切酶酶切位點以完成載體構建。將合成的單鏈DNA oligo（干粉）溶解于退火緩沖液中（終濃度20 μm），90 ℃水浴15 min。冷卻至室溫后，形成帶有黏性末端的雙鏈。然后插入由XmaⅠ/SmaⅠ酶切的慢病毒GV110載體（購自上海吉凱基因生物公司），并進行轉化和鑒定。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、病毒感染及篩選穩(wěn)定敲減細胞株：結直腸癌細胞系HCT116在37 ℃、5%CO2且濕度飽和條件下，使用含10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素的McCoy's 5A培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

根據(jù)病毒感染說明書，細胞密度達到30%~40%時吸去培養(yǎng)基，換為新培養(yǎng)基，量為原培養(yǎng)基的一半，加入Polybrene（50 μg/mL）和用ENI.S稀釋SRSF7-shRNA和control-shRNA病毒，8～12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。72～96 h熒光顯微鏡下觀察觀察GFP表達效率。加入嘌呤霉素進行篩選，每24 h更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，2 d傳代1次，0.25%胰酶消化傳代，傳代3~4次后收集細胞。

1.2.3 裸鼠的飼養(yǎng)與細胞接種

1.2.3.1 裸鼠的飼養(yǎng)：隨機分組，每組5只，SPF無菌環(huán)境中飼養(yǎng)，恒溫、恒濕、清潔、無特殊病原體，每3 d定期更換墊料，清潔飲用水、飼料供裸鼠自由攝入。

1.2.3.2 細胞接種：取處于對數(shù)期細胞用胰酶消化，經離心后收集細胞，用無血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)，控制每毫升細胞數(shù)1×107/mL。使用刻度為1 mL的注射器抽取處理好的細胞懸液0.2 mL，待皮下注射使用。

實驗組和對照組分別注射穩(wěn)定敲低SRSF7和轉染空載體的HCT116細胞。觀察待成瘤后每天測量瘤體的長徑和短徑，腫瘤體積計算方式：體積V（mm3）＝長徑（L）×短徑（W）2/2。

1.2.4 瘤體分離：待腫瘤長到1~1.5 cm3時，采取脫頸處死裸鼠。用實驗手術器械對腫瘤進行腫瘤取材。將腫瘤浸入生理鹽水中，將做石蠟切片的部分取材后浸入4%多聚甲醛，其余部分做RNA提取，然后分別打開胸腔、腹腔繼續(xù)觀察。

1.2.5 組織RNA提取和Real-time PCR：將腫瘤組織放在預冷的研缽，加入適量液氮。用Trizol法提取腫瘤內的RNA，經逆轉錄成cDNA，然后進行Real-timePCR反應，反應條件為條件為94 ℃預變性30 s循環(huán)1次，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s循環(huán)40次。本實驗中所使用引物序列如下：上游引物序列：ATGCTTATGATTGTCATCGTTACAGC，下游引物序列：GGAGATGCTGACCTTGACCTTC。

1.2.6 標本制作及免疫組化染色：將腫瘤組織置于4%多聚甲醛中固定過夜，然后進行石蠟包埋、切片。石蠟切片經過常規(guī)烤片、烘片處理后進行抗原修復，50 mL/L的牛血清白蛋白（BSA）封閉20~25 min后加入一抗37 ℃孵育1 h。PBS沖洗2 min×3次后，二抗孵育37 ℃ 20 min，然后使用DAB顯色劑顯色。蘇木素染色，封片。使用Image-J軟件對不同切片的染色強度進行檢測，然后進行統(tǒng)計學分析。

1.2.7 HE染色：切片制作完成后，入Coverstainer全自動HE染色封片機進行染色，依次經過烤片、二甲苯3 min×2次、100%乙醇1 min×2次、70%乙醇1 min、流水沖洗1 min、蘇木精1 min 30 s、流水沖洗1 min、蒸餾水1 min、藍化液1 min、流水沖洗1 min、95%乙醇1 min、伊紅2 min、100%乙醇1 min×3次、二甲苯2 min×3次，封片后結束HE染色程序。

1.2.8 統(tǒng)計學分析：本實驗結果均采用SPSS17.0和GraphPad Prism6.02統(tǒng)計學軟件處理，進行統(tǒng)計分析。兩組間的差異統(tǒng)計采用t檢驗；P<0.05認為具有統(tǒng)計學顯著性差異。

圖1 敲減SRSF7基因后，裸鼠移植瘤生長曲線

圖2 移植瘤SRSF7 RNA的表達水平的檢測

圖3 HE染色和免疫組化Ki-67、cleaved Caspase-3在實驗組和對照組中的表達（×40）

2 結 果

2.1 SRSF7shRNA慢病毒感染結直腸癌細胞HCT116及篩選：我們成功構建了SRSF7shRNA慢病毒，感染HCT116細胞后，篩選穩(wěn)定敲低SRSF7細胞株，其中shCtrl是對照組，sh-SRSF7是實驗組。選出生長狀態(tài)良好及穩(wěn)定表達綠色熒光的細胞。

2.2 SRSF7移植瘤動物模型的建立：裸鼠在接種1周后肉眼便可見皮下有一約0.1 cm3大小的腫塊結節(jié)。每天觀察，分別記錄成瘤時間和瘤體的體積。繪制移植瘤的生長曲線，由圖1可見，實驗組裸鼠的瘤體體積及生長速度較對照組明顯減慢，有顯著差異（P＜0.05）。

2.3 SRSF7mRNA表達水平的鑒定：采用Real-time PCR實驗分析移植瘤中SRSF7 mRNA的表達情況，由圖2結果顯示SRSF7在實驗組的表達水平低于對照組，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 移植瘤免疫組化染色的檢測：結直腸癌腫瘤動物模型建立后，分別取移植瘤進行HE染色和Ki-67、cleaved Caspase-3的免疫組化染色。由圖3結果顯示，腫瘤細胞異型性明顯，核大深染，核分裂像多見，排列為不規(guī)則的細胞結構；統(tǒng)計分析實驗組的Ki-67表達陽性率較對照組減少66%；同時觀察到實驗組的cleaved Caspase-3表達陽性率較對照組增加37%，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

腫瘤動物水平的研究相比較腫瘤細胞水平更能模擬人體內環(huán)境的生長情況。因此，在細胞水平的基礎上進一步進行動物水平的研究是腫瘤研究和治療的重要一步。

腫瘤的動物模型包括自發(fā)腫瘤模型、誘發(fā)腫瘤模型、同種移植腫瘤模型、異種移植腫瘤模型等[6]，其中異種移植模型是目前最常用于研究惡性腫瘤的方法，其常用的荷瘤動物是免疫缺陷動物[7]。由于裸鼠具有免疫缺陷的特點，在實驗條件下，一般不排斥來自異種動物的細胞或組織移植，因此可以作為移植人類惡性腫瘤的接受體[8]。目前，常用于建立結直腸癌移植瘤動物模型的方法包括細胞移植和組織移植，根據(jù)其接種部位的不同，又可以分為皮下移植和原位移植[9]。其中，通過將結直腸癌細胞接種于免疫缺陷動物皮下所建立的皮下移植瘤模型，是目前腫瘤研究中應用最早和最為廣泛的，具有操作簡單、成瘤率較高，便于觀察腫瘤的發(fā)生、生長情況等優(yōu)點[10]。

Pre-mRNA選擇性剪接是基因轉錄后表達調控的一個重要機制，通過選擇性剪接可以產生不同的mRNA異構體，從而翻譯出不同的蛋白質[11]。剪接因子SRSFs可通過結合在pre-mRNA上的增強子上，或是競爭RNA結合位點而影響選擇性剪接[12]。有研究報道，SRSF7作為一種在腫瘤中高表達的原癌基因，通過細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑P21的表達水平來影響細胞的增殖[13]。

Ki-67是應用最廣泛的增殖細胞標記之一[14]，檢測Ki-67是評估人類各種組織增殖分化的簡單而可靠的方法。Cleaved Caspase-3是檢測細胞凋亡的標志之一，是細胞凋亡早期階段激活的關鍵蛋白酶，在細胞凋亡過程中起中心環(huán)節(jié)作用[15]，可以評估人類各種組織的凋亡情況。本實驗選取這兩種常用的指標進行免疫組化染色檢測，結果顯示實驗組Ki-67蛋白表達較對照組明顯增加，而cleaved Caspase-3表達較對照組減少。說明實驗組的腫瘤細胞生長與增殖活性小于對照組，而凋亡增加，從而證實敲減SRSF7基因對腫瘤的生長與增殖具有抑制作用。

研究發(fā)現(xiàn)SRSF7敲低可以抑制HCT116細胞的增殖和的凋亡，在此基礎上，我們通過構建SRSF7慢病毒顆粒，感染并篩選穩(wěn)定敲低SRSF7的HCT116，通過皮下注射BABL/c小鼠，成功建立結直腸癌皮下移植瘤模型，通過觀察及測量，發(fā)現(xiàn)實驗組移植瘤體積及生長速度較對照組減慢；通過Real-time PCR檢測移植瘤中SRSF7的表達情況，發(fā)現(xiàn)實驗組的表達較對照組明顯降低，綜合以上研究結果，進一步在動物水平驗證了敲減SRSF7具有抑制腫瘤生長的作用。