譚鎮(zhèn)濠，高敏，簡(jiǎn)榮超，譚乾開，張燕，唐小文，李鈺鈴，黃池光，余漢忠，盛釗君,3

（1.五邑大學(xué) 生物科技與大健康學(xué)院，廣東 江門 529020；2.恩平市農(nóng)業(yè)局，廣東 恩平 529400；3.江門大健康國(guó)際創(chuàng)新研究院，廣東 江門 529000）

果膠廣泛存在于植物細(xì)胞間質(zhì)中，其主要成分為D-半乳糖醛酸.因具有良好的增稠性、乳化穩(wěn)定性、凝膠性、吸附性和成膜性等特性，果膠常被用作食品添加劑、食品包裝膜、優(yōu)良的藥物制劑基質(zhì)等[1].我國(guó)對(duì)果膠的需求量非常大，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年消耗果膠1 500噸以上，其中約80%的果膠來源于進(jìn)口[2].商品果膠的來源非常有限，而作為馬鈴薯加工淀粉的副產(chǎn)物，馬鈴薯渣果膠含量較高（約占干基的15%～30%）且價(jià)廉易得，是提取果膠的良好原料[3].

有研究表明，蘋果渣果膠具有降血脂、抗氧化等作用[4-6]，但是對(duì)于馬鈴薯果膠的生物活性研究較少.果膠分子質(zhì)量大、水溶性差的特點(diǎn)，可能會(huì)阻礙甚至限制其生物功能的發(fā)揮.因此，本實(shí)驗(yàn)通過酸堿改性使得以馬鈴薯渣為原料提取的果膠生成長(zhǎng)度較短、分支較少的糖鏈，以降低其酯化度、增加其水溶性、提高其半乳糖醛酸的含量，從而更好地發(fā)揮其生物活性和功能.

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器

FA2004N電子天平（上海菁海儀器有限公司），雷磁PHS-3C pH計(jì)（上海儀電科技儀器股份有限公司），TD5A-WS離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），P70D20TL-D4型微波爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司），DZF-6090真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），Evolution 201紫外-可見分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）.

1.2 材料與試劑

馬鈴薯（購(gòu)于廣東省江門市），沒食子酸（Gallic Acid）（阿達(dá)瑪斯試劑有限公司），97%半乳糖醛酸（上海源葉生物科技有限公司），酚酞（上海泰坦科技股份有限公司），3-苯基苯酚（畢得醫(yī)藥科技有限公司），福林酚（上海麥克林生化科技有限公司），二苯代苦味?；杂苫―PPH）（阿發(fā)埃莎（中國(guó)）有限公司），2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（95+%）（美國(guó)Ark Pharm公司）.其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 樣品的提取及改性處理

2.1.1 馬鈴薯渣的制備

按文獻(xiàn)[7]方法制備馬鈴薯渣：馬鈴薯切小粉碎得到濕馬鈴薯渣，用四層紗布過濾除水，再用α-淀粉酶降解使馬鈴薯渣中淀粉的含量降到最低.酶解后的馬鈴薯渣經(jīng)滅酶后，用無(wú)水乙醇洗滌一次，以除去游離糖、部分色素和雜質(zhì)，擰干，60 ℃鼓風(fēng)干燥后粉碎過80目篩，儲(chǔ)存?zhèn)溆?

2.1.2 馬鈴薯果膠的提取

按文獻(xiàn)[8]方法稍作修改，采用微波輔助法提取馬鈴薯渣中的果膠.準(zhǔn)確稱取馬鈴薯渣粉0.5000 g于燒杯中，先加入12 mLpH=2的稀硫酸溶液，然后置于微波爐中加熱2 min.離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，并加入400μL飽和的硫酸鋁溶液，然后再用氨水調(diào)節(jié)至pH=5，置于50℃水浴鍋中加熱45 min.再離心（3000 r/min，10 min），棄去上清液，向沉淀中加入20 mL脫鹽液（95%乙醇:水:濃硫酸=60：37：3），攪拌均勻，脫鹽30 min，抽濾，干燥后得到馬鈴薯的果膠，多次提取備用.

2.1.3 馬鈴薯果膠的酸堿改性

準(zhǔn)確稱取3.0000 g馬鈴薯果膠于250 mL錐形瓶中，加入55℃蒸餾水200 mL，攪拌至果膠溶解，加入3 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10.0.在55℃的水浴鍋加熱攪拌45 min，冷卻至室溫后再加入3 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，置室溫下過夜.加入3倍體積的95%乙醇溶液，攪拌，得到大量的白色絮狀沉淀，抽濾后將沉淀置于真空干燥箱中干燥，得到酸堿改性果膠.改性果膠的得率按下式計(jì)算：

式中，m0為改性前馬鈴薯果膠的質(zhì)量/g，m1為改性后馬鈴薯果膠的干質(zhì)量/g.本實(shí)驗(yàn)中，酸堿改性馬鈴薯渣果膠的得率為60.1%.

2.2 馬鈴薯果膠的組成測(cè)定

果膠是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的酸性雜多糖，其主要成分為半乳糖醛酸.研究表明，由果膠水解得到的果膠低聚半乳糖醛酸具有降血脂、降血糖、防齲齒、抑菌等功效[9].而果膠中半乳糖醛酸含量與果膠的酯化度相關(guān).此外，馬鈴薯果膠中還含有多酚物質(zhì)，眾所周知，多酚具有非常好的抗氧化活性.因此，果膠的半乳糖醛酸含量、多酚含量是評(píng)價(jià)果膠品質(zhì)的重要指標(biāo).

2.2.1 半乳糖醛酸含量的測(cè)定

1）半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用間羥聯(lián)苯的方法[10]測(cè)定馬鈴薯果膠中的半乳糖醛酸的含量.配制60 μg/mL的半乳糖醛酸母液，再稀釋成系列濃度的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液.以半乳糖醛酸的濃度為橫坐標(biāo)（單位：mg/mL），以吸光度為縱坐標(biāo)（單位：Abs），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為y=77.387x+0.0144（R2=0.9981）.

2）樣品中半乳糖醛酸含量的測(cè)定

配制0.1 mg/mL的原果膠溶液和0.1 mg/mL的酸堿改性果膠溶液，分別吸取0.50 mL于兩根離心管中，后續(xù)操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相同，測(cè)定兩種樣品在520 nm波長(zhǎng)下的吸光度，設(shè)3次平行，最后代入線性回歸方程分別得出兩種果膠中的半乳糖醛酸含量.

2.2.2 多酚含量的測(cè)定

1）沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別準(zhǔn)確移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL和3.0 mL于7個(gè)25 mL的容量瓶中，再分別加入1.25 mL的福林酚試劑搖勻，靜置1 min，分別加入0.2 g/L的碳酸鈉溶液3.75 mL，用蒸餾水定容至刻度線，置于室溫下反應(yīng)30 min后，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各濃度的吸光度，且設(shè)3次平行.所配制的溶液中沒食子酸的濃度（單位：mg/mL）分別為：0.000、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010和0.012，以沒食子酸的濃度（單位：mg/mL）為橫坐標(biāo)，以測(cè)定的吸光度（單位：Abs）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為y=76.804x-0.0075（R2=0.9978）.

2）樣品中多酚含量的測(cè)定

配制10 mg/mL的原果膠溶液和10 mg/mL的酸堿改性果膠溶液，分別吸取2.5 mL原果膠溶液和改性的果膠溶液于兩個(gè)25 mL容量瓶中，后續(xù)操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相同，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各濃度的吸光度，且設(shè)3次平行.最后代入線性回歸方程得出兩種果膠樣品中的多酚含量.

2.2.3 樣品酯化度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.0500 g的果膠樣品于50 mL的蒸餾溫水中，溶解之后加入3滴酚酞溶液，用0.1 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行標(biāo)定，滴定至溶液出現(xiàn)粉紅色且維持1 min不褪色，記錄此時(shí)所用NaOH溶液的體積V1（單位：mL，下同）.再向溶液中加入3 mol/L的NaOH溶液2.5 mL，搖勻，靜置5 min后，緩慢加入3 mol/L的鹽酸至粉紅色消失，再加入2滴酚酞溶液，用0.1 mol/L的NaOH滴定至溶液再次呈現(xiàn)粉紅色且保持1 min不褪色，記錄第2次所用的NaOH體積V2.酯化度的計(jì)算如下：

2.3 馬鈴薯果膠抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

以95%的甲醇溶液為溶劑配制0.2 mmol/L的DPPH溶液.再取2 mL新配制的DPPH溶液分別與2 mL不同質(zhì)量濃度（0.0625～8.0000 mg/mL）的果膠樣品溶液混合均勻，在室溫避光處反應(yīng)20 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各濃度果膠樣品溶液的吸光度，記錄為1A；用2 mL 95%的甲醇溶液分別與2 mL不同質(zhì)量濃度的果膠樣品溶液混合均勻，在室溫避光處反應(yīng)20 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各濃度果膠樣品溶液的吸光度，記錄為A2；最后用2 mL的DPPH溶液與2 mL的蒸餾水混合，在室溫避光處反應(yīng)20 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度，記錄為A0.果膠樣品的DPPH清除率計(jì)算如下：2.3.2 ABTS自由基清除率的測(cè)定

用0.2 mol/L的PBS（磷酸鹽緩沖溶液）配制7.4 mmol/L的ABTS溶液（其中過硫酸鉀的濃度為2.6 mmol/L），配制方法為：用PBS直接配制7 mmol/L的ABTS溶液，再與4.9 mmol/L的K2S2O3等體積混合即得所需，避光反應(yīng)16 h后使用.使用前，先于紫外-可見分光光度計(jì)中測(cè)定ABTS溶液在734 nm處的吸光度，再用磷酸鹽緩沖溶液稀釋其吸光度至0.68～0.72，得到ABTS溶液的稀釋液，將稀釋后的ABTS溶液的吸光度記錄為A0.將原果膠和酸堿改性果膠分別配制成不同濃度（0.0625～8.0000 mg/mL）的溶液.取0.6 mL各濃度果膠樣品與6 mL的ABTS稀釋液混合，在室溫避光的條件下反應(yīng)20 min后在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，所記錄的吸光度為A1；同時(shí)將0.6 mL各濃度的果膠溶液與6 mL的磷酸鹽緩沖溶液混合，同樣在室溫避光的條件下反應(yīng)20 min后在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，所記錄的吸光度為A2.果膠樣品的ABTS清除率計(jì)算如下：

3 結(jié)果與分析

3.1 酸堿改性前后，馬鈴薯果膠的組成

改性前后馬鈴薯渣果膠的組成如表1所示.與改性前相比，酸堿改性果膠中的半乳糖醛酸含量提升了322 mg/g，酯化程度下降了46%.酯化度降低是由于在酸堿改性過程中，用堿處理果膠時(shí)引起了β-消除反應(yīng)，同時(shí)同聚半乳糖醛酸骨架解聚；酸處理時(shí)，優(yōu)先脫下了側(cè)鏈上的中性糖，使得半乳糖醛酸含量降低.兩種果膠的多酚含量均較低（＜5 mg/g），而且差異不明顯.說明馬鈴薯果膠中的抗氧化活性主要由其他物質(zhì)（如多糖）引起，而非多酚類物質(zhì).

表1 改性前后馬鈴薯渣果膠的組成

3.2 DPPH自由基清除率

DPPH是一種具有穩(wěn)定的氮中心自由基的光度測(cè)定分析試劑，常用于實(shí)驗(yàn)室抗氧化成分的體外抗氧化性評(píng)價(jià)[11].按照2.3.1所述的實(shí)驗(yàn)步驟，計(jì)算不同質(zhì)量濃度下兩種果膠的DPPH自由基的清除率；并以果膠樣品終濃度（單位：mg/mL）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)（單位：%），使用Graphpad Prism軟件繪制果膠濃度對(duì)DPPH自由基的清除率曲線.

圖1 不同質(zhì)量濃度下，馬鈴薯渣果膠對(duì)DPPH自由基的清除率

如圖1所示，兩種果膠的DPPH清除率都隨果膠質(zhì)量濃度的增加而增加，在終濃度低于0.25 mg/mL時(shí)，兩種果膠的DPPH清除率差異并不明顯；當(dāng)終濃度大于0.25 mg/mL時(shí)，酸堿改性果膠的DPPH清除率高于原果膠的DPPH清除率.通過非線性擬合得到原果膠和改性果膠的DPPH清除率的IC50值分別是3.2 mg/mL和1.2 mg/mL.原果膠的IC50值大于酸堿改性果膠的IC50值，說明酸堿改性果膠的DPPH自由基清除能力大于原果膠的DPPH自由基清除能力.由于果膠中的羥基和羧基均可作為氫的供體，且羧基更加活潑更容易解離出氫離子與DPPH自由基結(jié)合還原成DPPH-H，因此半乳糖醛酸含量高且酯化度低的酸堿改性果膠清除DPPH自由基的能力更強(qiáng).

3.3 ABTS自由基清除率

ABTS是穩(wěn)定的以氮為中心的水溶性自由基，可用于評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化活性.ABTS溶液與K2S2O3反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生藍(lán)綠色的發(fā)色基團(tuán)，果膠可以提供氫或電子使得ABTS發(fā)色基團(tuán)滅活，導(dǎo)致其藍(lán)綠色消失，由此推斷 ABTS的清除率越高其抗氧化活性越好.以果膠樣品的終濃度（單位：mg/mL）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的自由基清除率為縱坐標(biāo)（單位：%），使用Graphpad Prism軟件繪制各果膠濃度對(duì)ABTS清除率曲線.

如圖2所示，原果膠和改性果膠在終濃度低于0.1 mg/mL時(shí)，ABTS自由基的清除率隨濃度變化不明顯；當(dāng)終濃度＞0.1 mg/mL 時(shí)，二者對(duì)ABTS自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大顯著提高.當(dāng)果膠樣品濃度＜0.18 mg/mL 時(shí)，原果膠的ABTS自由基的清除率比改性果膠的高.當(dāng)果膠樣品濃度＞0.18 mg/mL 時(shí)，改性果膠的ABTS自由基的清除率比原果膠的高.通過非線性擬合得到原果膠和改性果膠ABTS自由基清除率的IC50值分別是0.41 mg/mL和0.37 mg/mL.原果膠的IC50值大于酸堿改性果膠的IC50值，證明酸堿改性果膠的ABTS自由基清除能力大于原果膠的ABTS自由基清除能力.

圖2 不同質(zhì)量濃度下，馬鈴薯渣果膠對(duì)ABTS自由基的清除率

4 結(jié)論

本研究對(duì)馬鈴薯果膠進(jìn)行酸堿修飾得到改性果膠，并測(cè)試了其組成與抗氧化活性.與未改性果膠相比，酸堿改性果膠的半乳糖醛酸含量提高、酯化度下降.酸堿改性果膠的DPPH和ABTS清除率呈質(zhì)量濃度依賴效應(yīng).未改性果膠對(duì)DPPH自由基的清除率的IC50值為3.2mg/mL，對(duì)ABTS自由基的清除率的IC50值為0.41 mg/mL；酸堿改性果膠對(duì)DPPH自由基的清除率的IC50值為1.2 mg/mL，對(duì)ABTS自由基的清除率的IC50值為0.37 mg/mL.由此可見，酸堿改性有助于果膠抗氧化活性的提高.本研究為馬鈴薯渣果膠在功能食品和化妝品上的應(yīng)用指出了新思路，這將有利于提高馬鈴薯渣這一廢棄物的綜合利用價(jià)值.