楊 姝，祖艷群，李 博，畢玉芬，何永美，賈 樂(lè)，李 元*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，昆明650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

由于采礦業(yè)、汽車工業(yè)和農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，目前我國(guó)土壤鎘（Cd）污染問(wèn)題較為嚴(yán)峻，其點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)7.0%，在8種無(wú)機(jī)污染物中位列第一[1]。重金屬Cd是一種植物非必需元素[2]，在較低水平下就能影響植物的生長(zhǎng)及生理生化過(guò)程[3]。氮代謝是植物的重要生理過(guò)程之一，決定了植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。Cd脅迫會(huì)影響植物的氮代謝過(guò)程[7]，導(dǎo)致硝酸還原酶（NR）活性受到抑制[5]，進(jìn)而減緩硝態(tài)氮的同化過(guò)程[6]。Cd脅迫也會(huì)影響谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）和谷氨酸脫氫酶（GDH）的活性[7-8]，從而導(dǎo)致氨態(tài)氮含量的變化[9]及一系列連鎖反應(yīng)，包括株高和生物量的變化[10]。此外也發(fā)現(xiàn)，一些氮代謝產(chǎn)物如脯氨酸、GSH和PCs在植物的Cd耐性方面起著非常重要的作用[11]。

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是一種優(yōu)良牧草，其氮代謝過(guò)程會(huì)受Cd脅迫的影響[12]。如Cd脅迫降低了“甘農(nóng)3號(hào)”苜蓿籽苗中可溶性蛋白的含量[13]。對(duì)葉片中脯氨酸含量的研究表明，隨著Cd脅迫濃度的增加，“新疆大葉”苜蓿的脯氨酸含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)[14]，而在相同Cd濃度的脅迫下，“新疆大葉”的脯氨酸含量大于“阿爾岡金”[15]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿的氮代謝過(guò)程與其產(chǎn)量和品質(zhì)有相關(guān)性[4]，表明氮代謝過(guò)程的Cd耐性可能是紫花苜蓿Cd耐性的一個(gè)重要表現(xiàn)方面。

本研究以20個(gè)紫花苜蓿品種為植物材料，以Cd脅迫前后11個(gè)氮代謝相關(guān)指標(biāo)的變化率作為分析的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，應(yīng)用主成分分析法和隸屬函數(shù)法得到綜合評(píng)價(jià)值并對(duì)20個(gè)品種氮代謝的Cd耐性進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)利用多元線性回歸法構(gòu)建各單項(xiàng)指標(biāo)與綜合評(píng)價(jià)值之間的數(shù)學(xué)模型，篩選出最能體現(xiàn)氮代謝Cd耐性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，以構(gòu)建紫花苜蓿氮代謝Cd耐性的評(píng)價(jià)體系，為篩選紫花苜蓿的耐Cd品種及Cd污染土壤的治理及綜合利用提供研究材料和研究模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

盆栽用土壤取自昆明市云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)（25°14′30″N，102°56′27″E），紅壤土，pH值6.83，有機(jī)質(zhì)含量為30.18 g·kg-1，全氮含量為2.68 g·kg-1，堿解氮含量為56.73 mg·kg-1，全磷含量為14.21 g·kg-1，速效磷含量為 82.83 mg·kg-1，全鉀含量為 16.06 g·kg-1，速效鉀含量為521.76 mg·kg-1，總Cd含量0.38 mg·kg-1，土壤過(guò)篩備用。選用的紫花苜蓿品種如表1所示，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，挑選大小一致且籽粒飽滿的種子，用10%H2O2進(jìn)行表面消毒10 min，再用蒸餾水沖洗多次后晾干備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用圓形塑料花盆（高45 cm，口內(nèi)徑40 cm），每盆裝土9 kg，在土壤中加入研成粉末狀的CdCl2·2H2O拌勻，使土壤Cd含量分別為0（CK）和50 mg·kg-1。按10 g·盆-1的量加入生石灰粉末拌勻調(diào)節(jié)土壤pH值至中性。按5 g·盆-1的量施入復(fù)混通用肥（N 10%，P2O510%，K2O 5%）作為底肥，用去離子水調(diào)節(jié)土壤含水量至最大持水量的60%左右，平衡兩周。按8?！づ?1的播種量，將苜蓿種子均勻撒播于盆內(nèi)，待出苗至株高10 cm時(shí)，每盆留5株，其余間去。生長(zhǎng)期間常規(guī)管理，待生長(zhǎng)至100 d時(shí)進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，共計(jì)120盆，隨機(jī)排列放置于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室大棚。

表1 苜蓿品種名稱及來(lái)源Table 1 Origin and name of alfalfa varieties

1.3 取樣與測(cè)定

待植株生長(zhǎng)至100 d時(shí)，測(cè)定株高。以盆為單位收獲植株，用蒸餾水洗凈晾干表面水分后，測(cè)定其生物量。葉片鮮樣中氮代謝關(guān)鍵酶（NR、GS、GOGAT、GDH）活性使用酶活性測(cè)定試劑盒（Solarbio，北京索萊寶科技有限公司）測(cè)定。葉片鮮樣中硝態(tài)氮含量采用5%硫酸-水楊酸提取比色法測(cè)定[4，11]，總游離氨基酸采用茚三酮溶液顯色法測(cè)定[16]，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[17]，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測(cè)定[18]。整株鮮樣放入真空干燥箱內(nèi)105℃殺青30 min，而后將溫度調(diào)至70℃烘至恒質(zhì)量，研磨干樣至粉末狀并過(guò)篩后，使用凱式定氮法測(cè)定植株總氮含量[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進(jìn)行常規(guī)計(jì)算及分析，相關(guān)性分析、主成分分析和多元線性回歸分析采用SPSS軟件處理。

式中，RCi為第i個(gè)品種在Cd脅迫下的指標(biāo)變化率。Uij為第i個(gè)品種在j公因子中的隸屬函數(shù)值，Cij表示第i個(gè)品種在第j個(gè)公因子中的得分，Cmin表示所有品種在第j個(gè)公因子中的最小得分，Cmax表示所有品種在第j個(gè)公因子中的最大得分。Wj為第j個(gè)公因子的權(quán)重系數(shù)，Pj為第j個(gè)公因子的貢獻(xiàn)率。Di為第i個(gè)品種的綜合評(píng)價(jià)值。下標(biāo)i表示受試紫花苜蓿品種的編號(hào)，取值為1，2，3，…20，下標(biāo)j指主成分分析提取的公因子數(shù)（主成分?jǐn)?shù)），在本論文中的取值為1、2。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫下紫花苜蓿氮代謝指標(biāo)的變化率

在外源添加Cd濃度為50 mg·kg-1時(shí)，與對(duì)照相比，20個(gè)紫花苜蓿品種的株高、生物量、氮含量、氮代謝酶活性、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量、脯氨酸含量和硝態(tài)氮含量等11個(gè)指標(biāo)均有不同程度的變化（圖1）。其中，株高增加最大的品種是“巨人”（58.18%），而減少最大的品種是“中苜1號(hào)”（-24.94%）。從生物量看，增加和降低幅度最大的品種分別是“新牧2號(hào)”（58.64%）和“游客”（-21.04%）。結(jié)果顯示，全氮含量的變化范圍在16.04%～-30.01%之間，增加最大的品種為“苜蓿王”，而減小最大的品種為“多葉”。從可溶性蛋白含量看，品種“德欽”增加最多，增幅達(dá)36.18%，而品種“四季旺”降幅最大，達(dá)-34.85%。各品種游離氨基酸含量也有較大變化，其中增幅最大品種是“前景”，達(dá)49.60%，而降幅最大品種為“多葉”，達(dá)-45.52%。脯氨酸含量的變化范圍為89.63%～-35.76%，最大增幅和降幅的品種分別為“國(guó)產(chǎn)”和“中苜1號(hào)”。硝態(tài)氮含量變化幅度也較大，其中增幅最大和降幅最大的品種為“WL525HQ”和“金皇后”，其值分別達(dá)122.24%和-68.30%。氮代謝關(guān)鍵酶NR、GS、GOGAT和GDH活性的指標(biāo)變化率范圍分別為66.68%（新牧2號(hào)）～-83.00%（WL525HQ）、76.36%（草原1號(hào)）～-45.71%（三得利）、97.79%（國(guó)產(chǎn)）～-73.22%（游客）和75.44%（國(guó)產(chǎn)）～-74.97%（WL525HQ）。

2.2 各氮代謝指標(biāo)間的相關(guān)性分析

分析20個(gè)紫花苜蓿品種在Cd脅迫下各項(xiàng)指標(biāo)變化率的相關(guān)性（表2）。結(jié)果顯示，在株高、生物量、全氮含量、NR活性和GOGAT活性這5個(gè)指標(biāo)之間，兩兩均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），GS活性與可溶性蛋白含量、脯氨酸含量之間互呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。而硝態(tài)氮含量則與株高、生物量、全氮含量、游離氨基酸含量、NR活性、GS活性和GOGAT活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與可溶性蛋白含量、脯氨酸含量和GDH活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。此外，GDH活性與GOGAT活性之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與全氮含量、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量和脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

2.3 主成分分析

使用SPSS軟件對(duì)20個(gè)品種中11個(gè)指標(biāo)的變化率進(jìn)行主成分分析并提取關(guān)鍵因子（表3）。結(jié)果表明，第一主成分的特征根為7.376，貢獻(xiàn)率達(dá)67.053%，第二主成分的特征根為1.007，貢獻(xiàn)率為9.158%，從第三主成分開(kāi)始，其特征根均小于1。第一和第二主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)76.212%，已大于75%，因此可將原有的11個(gè)指標(biāo)降維整合為2個(gè)因子，這兩個(gè)因子是新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，能概括原始指標(biāo)攜帶的絕大部分信息。

由成分得分系數(shù)發(fā)現(xiàn)（圖2），主成分1的值與指標(biāo)株高、生物量、全氮、NR和GS呈正相關(guān)關(guān)系，而與指標(biāo)游離氨基酸、可溶性蛋白、脯氨酸、硝態(tài)氮、GOGAT和GDH呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中株高、生物量和GDH的載荷較大，分別為0.329、0.306和-0.327。主成分2的值與全氮、可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸、硝態(tài)氮、NR、GOGAT和GDH呈正相關(guān)關(guān)系，而與株高、生物量和GS活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中可溶性蛋白、游離氨基酸和GDH的載荷較大，分別為0.247、0.293和0.512。

圖1 Cd脅迫下20個(gè)紫花苜蓿品種的指標(biāo)變化率Figure 1 Index change rates of 20 alfalfa cultivars under Cd stress

表2 Cd脅迫下20個(gè)紫花苜蓿氮代謝相關(guān)指標(biāo)變化率的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of indicators change rate in nitrogen metabolism of 20 alfalfa cultivars under Cd stress

表3 主成分的特征根和貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalue and contribution rates of principal components

2.4 Cd耐性綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)成分得分系數(shù)，各品種在兩個(gè)因子中的分值（Cij）計(jì)算函數(shù)分別為:

Ci1=0.329×株高+0.306×生物量+0.004×全氮-0.065×可溶性蛋白-0.113×氨基酸-0.021×脯氨酸-0.223×硝態(tài)氮+0.164×NR+0.295×GS-0.009×GOGAT-0.327×GDH

Ci2=-0.210×株高-0.182×生物量+0.180×全氮+0.247×可溶性蛋白+0.293×氨基酸+0.200×脯氨酸+0.092×硝態(tài)氮+0.001×NR-0.187×GS+0.189×GOGAT+0.512×GDH

圖2 氮代謝相關(guān)指標(biāo)的成分得分系數(shù)Figure 2 Component score coefficient of nitrogen metabolismrelated indicators

利用公式（3）得出主成分1和主成分2的權(quán)重系數(shù)分別為0.880和0.120。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)公式（2）和（4）計(jì)算出各品種的隸屬函數(shù)值（Uij）和綜合評(píng)價(jià)值（Di）（表4）。結(jié)果顯示，在20個(gè)品種中，“巨人”的Di值最大，為0.89，表明其氮代謝具有最強(qiáng)的耐Cd性。其后依次為“金皇后”“新牧2號(hào)”“草原1號(hào)”“維多利亞”和“隴中苜?！?，它們的D值分別為0.87、0.84、0.81和0.80，說(shuō)明它們的氮代謝均具有相對(duì)較高的耐Cd性。而“三得利”“WL525HQ”“四季旺”和“游客”幾個(gè)品種的Di值均小于0.1，表明其氮代謝對(duì)Cd的脅迫較為敏感。

2.5 D值的回歸模型及評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選

為分析各指標(biāo)變化率與試驗(yàn)品種Cd耐性間的關(guān)系，篩選較為可靠的紫花苜蓿Cd耐性鑒定指標(biāo)，以Cd耐性綜合評(píng)價(jià)值（D）作為因變量，把在Cd脅迫下各單項(xiàng)指標(biāo)的變化率視為自變量，開(kāi)展多元線性逐步回歸分析，得到相應(yīng)的回歸方程:

表4 20個(gè)紫花苜蓿品種氮代謝指標(biāo)的主成分得分和綜合得分Table 4 Principal component scores and synthesis score of 20 alfalfa cultivars

D=0.331+0.002×株高+0.002×GS-0.002×GDH-0.002×硝態(tài)氮+0.001×NR+0.003×生物量

其中，方程決定系數(shù)R2=0.999，P=0.000。從方程中發(fā)現(xiàn)，株高、GS、GDH、硝態(tài)氮、NR和生物量這6個(gè)指標(biāo)對(duì)D值有顯著影響，即這6個(gè)指標(biāo)的變化率能較好體現(xiàn)紫花苜蓿氮代謝對(duì)Cd脅迫的耐性，通過(guò)該方程計(jì)算Cd耐性綜合評(píng)價(jià)值（D），可初步預(yù)測(cè)不同紫花苜蓿品種氮代謝對(duì)Cd脅迫的耐性。

3 討論

研究表明，Cd脅迫下紫花苜蓿的株高、根長(zhǎng)、根質(zhì)量、地上部質(zhì)量等指標(biāo)會(huì)發(fā)生變化[20]，這種變化存在品種差異，一些耐性強(qiáng)的品種表現(xiàn)為增加，而一些耐性弱的品種表現(xiàn)為降低[21]。在本試驗(yàn)中Cd脅迫導(dǎo)致9個(gè)品種的株高增加而11個(gè)品種的株高下降，生物量的變化趨勢(shì)與此相同，說(shuō)明紫花苜蓿對(duì)Cd的耐性可較直觀地通過(guò)株高和生物量指標(biāo)的變化率表現(xiàn)出來(lái)。在Cd脅迫下，植物的生長(zhǎng)會(huì)因氮同化酶（NR、NiR、GS）活性受到抑制而減緩[14]，對(duì)紫花苜蓿的研究則發(fā)現(xiàn)其氮含量對(duì)其生物量的形成有著直接的影響[22]。在本試驗(yàn)中，Cd處理后20個(gè)品種的株高變化率和NR、GS、GOGAT活性變化率均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），20個(gè)品種的生物量變化率和NR、GS、GOGAT活性變化率及總氮含量變化率之間也呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），這與前人研究結(jié)果相符。表明Cd脅迫對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響可能是通過(guò)對(duì)氮代謝過(guò)程的影響來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

脯氨酸、游離氨基酸和可溶性蛋白是氮代謝過(guò)程的重要代謝產(chǎn)物。通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化、保護(hù)酶活性和維持生物膜完整性，脯氨酸能夠調(diào)節(jié)滲透壓以應(yīng)對(duì)Cd脅迫[23]，本研究發(fā)現(xiàn)，20個(gè)品種的脯氨酸含量變化率與株高和生物量變化率均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），這也印證了Cd脅迫條件下，紫花苜蓿可通過(guò)體內(nèi)脯氨酸含量的增加來(lái)抵御Cd毒[18]。Cd脅迫也會(huì)影響植株中游離氨基酸和可溶性蛋白的含量[16，24]，游離氨基酸含量的增加有利于植物對(duì)逆境的抵御，可溶性蛋白含量的增加有助于維持細(xì)胞代謝的正常進(jìn)行，還可能合成一類能與Cd特異結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽，從而減輕毒害[25]。在本試驗(yàn)中，20個(gè)品種的游離氨基酸含量變化率與總氮含量變化率呈顯著相關(guān)（P＜0.01），可溶性蛋白含量變化率與株高、生物量和總氮含量變化率均呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），也驗(yàn)證了前人研究結(jié)果?？梢?jiàn)，氮代謝過(guò)程產(chǎn)物脯氨酸、游離氨基酸和可溶性蛋白可作為考察紫花苜蓿Cd耐性的重要指標(biāo)。在相同濃度的Cd脅迫下，Cd耐性強(qiáng)的品種其脯氨酸、游離氨基酸和可溶性蛋白含量相對(duì)較高。

氮代謝過(guò)程的Cd耐性是紫花苜蓿Cd耐性的一個(gè)重要表現(xiàn)方面。氮代謝過(guò)程的相關(guān)指標(biāo)可作為評(píng)估紫花苜蓿Cd耐性的重要參考依據(jù)。氮代謝過(guò)程非常復(fù)雜，所涉及的指標(biāo)也較多[8]，且指標(biāo)與指標(biāo)之間也存在著相互聯(lián)系和相互影響的關(guān)系，因此不能片面地采用某個(gè)單一指標(biāo)對(duì)紫花苜蓿氮代謝的Cd耐性進(jìn)行評(píng)估。只有將多個(gè)具有代表性的指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，其結(jié)果才具有一定的說(shuō)服力和可借鑒性[26]。主成分分析可將原來(lái)數(shù)量較多的單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成新的個(gè)數(shù)較少且彼此獨(dú)立的綜合指標(biāo)，進(jìn)一步利用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)分析法求出各綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)值（D值）[27]，比較客觀地反映各參試品種的Cd耐性。在本實(shí)驗(yàn)中，紫花苜蓿的11個(gè)氮代謝相關(guān)指標(biāo)被轉(zhuǎn)換成2個(gè)新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，這2個(gè)指標(biāo)概括了原始指標(biāo)攜帶的絕大部分信息，結(jié)合隸屬函數(shù)法，可以較為方便地對(duì)紫花苜蓿氮代謝的Cd耐性進(jìn)行評(píng)估。

4 結(jié)論

氮代謝過(guò)程的Cd耐性可作為衡量紫花苜蓿Cd耐性的一個(gè)重要依據(jù)。11個(gè)氮代謝相關(guān)指標(biāo)經(jīng)主成分分析降維為2個(gè)新的獨(dú)立的指標(biāo)，以此計(jì)算得到的綜合評(píng)價(jià)值（D）顯示品種“巨人”和“三得利”分別具有最強(qiáng)和最弱的氮代謝Cd耐性。D值的線性回歸分析顯示株高、GS、GDH、硝態(tài)氮、NR和生物量6個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)可作為評(píng)價(jià)紫花苜蓿氮代謝Cd耐性的主要指標(biāo)，為紫花苜蓿Cd耐性品種的篩選與鑒定提供依據(jù)和數(shù)學(xué)模型。