董貴俊 溫含 張英祥 田雪文 李可峰 葛新發(fā)

1 山東體育學(xué)院（濟(jì)南250102）

2 天津體育學(xué)院（天津300381）

骨骼肌鈍挫傷是常見的運(yùn)動(dòng)損傷，特別是股四頭肌和腓腸肌的鈍挫傷最為常見[1]。鈍挫傷后受損組織由于細(xì)胞損壞、血管破損、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、缺血后再灌注等因素導(dǎo)致局部組織供氧不足[2，3]，有氧代謝能力顯著下降從而誘發(fā)能量供給障礙[4]，不利于受損部位通過自身循環(huán)代謝完成自身免疫、肌纖維再生與重組，從而嚴(yán)重影響損傷后的恢復(fù)速度[5，6]。低氧誘導(dǎo)因子-1（hy?poxia-inducible factor-1，HIF-1）是細(xì)胞中缺氧應(yīng)激調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[7，8]。HIF-1 是異源二聚體蛋白，主要由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成，其中HIF-1α亞基受缺氧調(diào)控并調(diào)節(jié)HIF-1 的活性。在缺氧條件下，HIF-1 被激活后調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)機(jī)體對(duì)缺氧應(yīng)激反應(yīng)的信號(hào)通路。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是具有α1 或α 2催化亞基的異三聚體，它是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，當(dāng)ATP濃度水平降低時(shí)，AMPK可被激活[9]。

機(jī)體能量供應(yīng)不足或氧化應(yīng)激狀態(tài)下，產(chǎn)生大量活性氧簇（ reactive oxygen species，ROS），進(jìn)而影響線粒體分裂-融合的平衡使得線粒體從形態(tài)上進(jìn)行代償[10，11]。而且，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高、線粒體分裂-融合的動(dòng)態(tài)變化也會(huì)促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生[12，13]，以清除功能障礙、受損的線粒體，達(dá)到保持細(xì)胞生理功能穩(wěn)定、抑制活性氧的作用[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的ROS也可直接激活HIF-1[7]。Bnip3 和Nix 是HIF-1 的靶基因，屬于促凋亡蛋白，在缺氧條件下可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[17，18]。

骨骼肌鈍挫傷后，受損組織缺血造成缺氧環(huán)境，有氧代謝能力顯著下降進(jìn)而造成能量供給障礙，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，誘發(fā)ROS 水平升高。缺氧或ROS 水平升高可能激活能量代謝和缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵因子表達(dá)，從而誘發(fā)鈍挫傷后線粒體自噬相關(guān)基因表達(dá)及自噬體發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)線粒體更新以利于其質(zhì)量控制，但目前關(guān)于鈍挫傷后線粒體自噬發(fā)生情況及相關(guān)機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過建立中等程度腓腸肌鈍挫傷模型，研究鈍挫傷后能量代謝關(guān)鍵因子及自噬相關(guān)蛋白，包括AMPKα2、HIF-1α、BNIP3 和NIX 的表達(dá)情況，探討腓腸肌鈍挫傷后自噬發(fā)生的可能誘發(fā)機(jī)制，對(duì)于揭示鈍挫傷后線粒體損傷重建機(jī)制具有重要理論意義。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

Wistar 雄性大鼠64 只，體重210～230 g。大鼠及大鼠常規(guī)飼料由山大動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供。在山東體育學(xué)院動(dòng)物房飼養(yǎng)大鼠。動(dòng)物飼養(yǎng)房光照周期被控制為12 h/12 h 明暗循環(huán)（早08：00 亮燈，晚20：00 關(guān)燈），大鼠被飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)籠內(nèi)，采取一籠一鼠的飼養(yǎng)方式。標(biāo)準(zhǔn)條件下，自由進(jìn)食、飲水，每周更換3次墊料，保持通風(fēng)，室溫（21 ± 1）℃，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用獲得相關(guān)的動(dòng)物管理及使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

隨機(jī)分為8 組（n=8）。一組為對(duì)照組，另7 組為鈍挫傷組。鈍挫傷組按照傷后取材時(shí)間又分為12 h組、2 d組、5 d組、7 d組、10 d組、15 d組、30 d組。參考董貴俊[5]等鈍挫傷方法造模：將實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔10g/L 硫噴妥鈉注射麻醉后，固體木制圓柱體下落導(dǎo)致右小腿內(nèi)側(cè)面（其皮下為腓腸肌中段）一次打擊傷。打擊半徑0.5 cm，打擊體長(zhǎng)度1.16 m，質(zhì)量0.62 kg，打擊高度0.40 m，打擊重力為6108 N，打擊動(dòng)能為2143 J。解剖學(xué)指標(biāo)、CK 等生理指標(biāo)綜合分析鑒定為中度損傷[13]。造模后按時(shí)間順序取腓腸肌，部分置入－80℃冰箱保存用于電鏡制片和qRT-PCR，部分直接提取蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）檢測(cè)。

1.2 研究方法

1.2.1 透射電鏡觀察受損部位自噬體形成

腓腸肌取材后經(jīng)生理鹽水漂洗，于2%多聚甲醛-2.5%戊二醛中4℃固定2 h，后經(jīng)0.1M磷酸緩沖液漂洗15 min，重復(fù)3次，隨后保存于緩沖液中，并于4℃冰箱保存過夜。第2天將保存過夜的材料于1%鋨酸中固定1 h，后置于50%、70%、90%、100%乙醇中依次浸泡15 min；再用100%乙醇、丙酮（1：1）混合液中固定15 min；最后在100%丙酮中固定15 min。

將固定好的組織塊在100%丙酮、包埋液（1∶1）混合液中室溫浸透2 h進(jìn)行包埋，37℃烘箱中12 h，之后于60℃放置24 h 進(jìn)行聚合。用LEICA EM UC6 超薄切片機(jī)將組織塊切成規(guī)格為60～70 nm 超薄切片，每只大鼠同一取材部位包埋塊選取3張，于HITACHI H-7650 透射電鏡下選擇10 個(gè)相鄰的非重疊視野觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.2 RNA提取，反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR

1.2.2.1 總RNA提取

取液氮中冷凍的腓腸肌組織0.2 g，研碎后加入1 mL Trizol（Sigma，USA）充分研磨，轉(zhuǎn)入EP 管中室溫靜置5 min。以5∶1（V/V）Trizol：氯仿的比例加入氯仿，漩渦震蕩15 秒，室溫靜置3 min，4℃12000 r/min，離心15 min。取上層水相，按2∶1（V/V）Trizol：異丙醇的量加入異丙醇，室溫放置10 min，4℃12000 r/min 離心10 min。棄上清，以1∶1 等比例加入75%乙醇進(jìn)行洗滌，7500 r/min，4℃離心5 min，棄上清。將沉淀的RNA在室溫下干燥6 min，后用20 μL RNase-free water 重懸RNA，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR

總RNA 提取后，應(yīng)用NanoPhotometer P330（Im?plen，Munich，Germany）對(duì)RNA 濃度和質(zhì)量進(jìn)行鑒定。取適量組織總RNA（不超過50 ng）采用試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermen?tas，USA）進(jìn)行反轉(zhuǎn)。隨后，采用SYBR green（Ap?plied Biosystems，CA，USA）做為熒光染料進(jìn)行qRTPCR，程序設(shè)計(jì)如下：95 ℃30 s，1 循環(huán)；95 ℃，5 s，60 ℃ 30 s，40 循環(huán)（Applied Biosystems StepOne ?Fast Real-time PCR system）。實(shí)驗(yàn)中所使用的引物見表1。目的基因的RNA表達(dá)水平的相對(duì)定量分析采用2-ΔΔCt方法。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)

總蛋白提?。喝∵m量組織置于玻璃勻漿器，加200 μL RIPA 裂解液，手動(dòng)研碎并置于冰上30 min 后14000 轉(zhuǎn)離心20 min，吸上清，提取組織總蛋白并使用Nanodrop超微量核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)SDS-PAGE 上樣量需要，取適量樣品加入4×loading buffer后，100℃煮沸變性5 min。

SDS-PAGE 電泳：分離膠凝膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%。上樣量為10 μL。濃縮膠恒壓80V，約40 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。

轉(zhuǎn)膜：采用濕法轉(zhuǎn)膜設(shè)置，恒流300 mA，冰浴轉(zhuǎn)膜2 h。

Western blotting：（1）封閉：將膜浸沒在Western blotting 封閉液Ⅱ（TBST 溶解的5%脫脂奶粉，pH7.5）中室溫輕搖90 min（封閉液須覆蓋整張膜，且膜在其中能夠搖動(dòng)為宜）。（2）一抗孵育：用Western blotting封閉液Ⅱ按1：500 稀釋一抗，室溫孵育30 min，放4℃過夜。（3）洗膜：TBST 洗膜7 次，每次5 min。（4）二抗孵育：用Western blotting 封閉液Ⅱ稀釋二抗，目的蛋白用羊抗鼠-HRP 1∶20000或羊抗兔-HRP 1：10000（根據(jù)一抗進(jìn)行選擇）室溫孵育60 min。（5）洗膜：TBST 洗膜7 次，每次5 min。（6）ECL 反應(yīng)、曝光掃描：一張8 cm×6 cm大小的膜用1 ml ECL（500 μl A 液+500 μl B 液）室溫避光反應(yīng)5 min，曝光1 min（曝光時(shí)間隨不同光強(qiáng)度而調(diào)整）。（7）內(nèi)參用羊抗鼠β-tabulin 1：500稀釋，室溫孵育30 min，放4℃過夜，洗膜7遍，每次5 min，再加羊抗鼠-HRP 1∶10000 二抗，室溫孵育60 min，洗膜7次，每次5 min。

主要試劑及儀器如下：β-tubulin 兔抗單克隆抗體（Cat#：ab179513）、AMPKα2 兔抗多克隆抗體（Cat#：ab3760）、HIF-1α 兔抗單克隆抗體（Cat#：14179S）、BNIP3 兔抗單克隆抗體（Cat#：ab109362）、NIX 兔抗多克隆抗體（Cat#：ab83808）由abcam Co.Ltd提供；山羊抗兔IgG（H+L）HRP（Cat#：ZB2301）由ZSGB-BIO. Co.Ltd提供；總蛋白抽提試劑盒（Cat#：BSP003）購(gòu)自Sangon?bio.Co.Ltd；高靈敏ECL 發(fā)光試劑盒（Cat#： WB?KLS0500）、PVDF 膜（Cat#：IPVH00010）購(gòu)自Millipore公司；Western Show預(yù)染蛋白Marker（Cat#：26616）購(gòu)自Thermo.Co.Ltd；Western blotting 封閉液Ⅱ（奶粉，pH7.5）（Cat#：PC0020）、TBS（pH8.0，20 ×）（Cat#：T1080）、SDS-PAGE 上樣緩沖液（還原，4×）（Cat#：P1015）購(gòu)自Solarbio.Co.Ltd。Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System、BIO-RAD ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)、Powerpac Basic電泳儀由BIO-RAD（USA）提供；溫控?fù)u床由New Brunswich（USA）提供；Nanodrop超微量核酸蛋白測(cè)定儀由Thermo公司（USA）提供。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

本研究中所有數(shù)據(jù)均用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選擇單因素方差分析各組均值的組間差異。研究數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差± s）的形式表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 鈍挫傷后骨骼肌缺氧、自噬相關(guān)因子HIF-1α、AMPKα2、BNIP3、NIX蛋白表達(dá)

鈍挫傷后，12 h、2 d組腓腸肌HIF-1α蛋白質(zhì)的表達(dá)水平比對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；隨后表達(dá)水平逐漸下降，但5 d、7 d、10 d組的表達(dá)水平仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；傷后15 d、30 d組，HIF-1α蛋白表達(dá)水平基本恢復(fù)至正常水平（P＞0.05）（圖1）。

圖1 不同組別HIF-1α表達(dá)柱狀圖（n=8）

鈍挫傷后，與對(duì)照組相比，腓腸肌AMPKα2蛋白質(zhì)12 h、2 d、5 d 組誘導(dǎo)表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。7 d、10 d、15 d、30 d組與對(duì)照組相比無顯著差異（圖2）。

圖2 不同組別AMPKα2表達(dá)柱狀圖（n=8）

腓腸肌鈍挫傷后12 h、2 d、5 d、7 d、10 d 組的BNIP3 表達(dá)水平比對(duì)照組顯著提高，特別是12 h 組和2 d 組BNIP3 表達(dá)表達(dá)水平是對(duì)照組的1.9 倍（P＜0.01），傷后5 d、7 d、10 d 組BNIP3 表達(dá)水平較12 h、2 d組時(shí)有所回落，但仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同組別BNIP3表達(dá)柱狀圖（n=8）

NIX 灰度值比較發(fā)現(xiàn)，腓腸肌損傷發(fā)生后12 h、2 d 組的NIX 表達(dá)水平是對(duì)照組的4 倍（P＜0.01），5 d 組的表達(dá)水平是對(duì)照組的2.5 倍（P＜0.05），7 d 組的表達(dá)水平仍維持在對(duì)照組的1.6倍（P＜0.05），10 d組的表達(dá)水平與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）（圖4）。

圖4 不同組別NIX表達(dá)柱狀圖（n=8）

圖5 顯示HIF-1α、AMPKα2、BNIP3 和NIX 四個(gè)蛋白表達(dá)特點(diǎn)是表達(dá)量趨勢(shì)圖呈現(xiàn)出四條開口向下的拋物線，峰值前斜率大，既短期內(nèi)迅速升高至最高點(diǎn)；峰值后形成一個(gè)小平臺(tái)期，后開始以相對(duì)較小斜率恢復(fù)，直至正常水平。

圖5 不同組別各蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)圖

2.2 鈍挫傷后骨骼肌缺氧相關(guān)因子Hif-1α、Ampkα2、Bnip3、Nix mRNA表達(dá)變化

圖6結(jié)果說明骨骼肌鈍挫傷發(fā)生后，傷后2 d、5 d組與對(duì)照組相比Hif-1α mRNA 表達(dá)增高，其中2 d 組增高非常顯著（P＜0.01），增高水平達(dá)到對(duì)照組4～5 倍左右；5 d組與對(duì)照組相比也有顯著增高（P＜0.05）。其余損傷組中僅12 h 組高于對(duì)照組，但并無顯著性差異，其他表達(dá)與對(duì)照組基本一致。

圖6 不同組別Hif-1α mRNA表達(dá)柱狀圖

圖7 結(jié)果表明骨骼肌鈍挫傷發(fā)生后，傷后12 h、2 d、5 d組與對(duì)照組相比Ampkα2 mRNA表達(dá)增高，其中12 h、2 d 組增高非常顯著（P＜0.01），增高水平近對(duì)照組3倍；5 d與對(duì)照組相比也有顯著增高（P＜0.05）。

圖7 不同組別Ampkα2 mRNA表達(dá)柱狀圖

圖8結(jié)果表明損傷組除15 d、30 d外，其余時(shí)間與對(duì)照組相比Bnip3 mRNA 表達(dá)增高，其中12 h、2 d 組增高非常顯著（P＜0.01），增高水平接近對(duì)照組3倍；5 d與對(duì)照組相比也有顯著增高（P＜0.05），表達(dá)量也近似于對(duì)照組的2 倍，7 d、10 d 組表達(dá)也明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖8 不同組別Bnip3 mRNA表達(dá)柱狀圖

圖9 表明損傷組與對(duì)照組相比Nix mRNA 表達(dá)在12 h、2 d 組增高非常顯著（P＜0.01），增高水平接近對(duì)照組3 倍；5 d 與對(duì)照組相比也有顯著增高（P＜0.05），表達(dá)量為對(duì)照組的2倍，7 d組表達(dá)也明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。

從趨勢(shì)上來看（圖10），Ampkα2、Bnip3、Nix mRNA變化趨勢(shì)與其蛋白表達(dá)基本吻合，三者均呈開口向下的拋物線，從損傷至傷后12 h 就達(dá)到峰值，其峰值延續(xù)到傷后2 d，形成一個(gè)小平臺(tái)期，此后形成斜率較小的下降期直至接近正常值；而傷后12 h骨骼肌中HIF-1α蛋白表達(dá)量已達(dá)峰值，而此時(shí)其mRNA 卻仍接近正常，且其峰值僅在傷后2 d一個(gè)取材點(diǎn)出現(xiàn)，并不呈現(xiàn)一個(gè)小平臺(tái)期，之后便開始下降直至恢復(fù)至正常水平。

圖9 不同組別Nix mRNA表達(dá)柱狀圖

圖10 不同取材時(shí)間點(diǎn)各mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)圖

2.3 鈍挫傷后腓腸肌超微結(jié)構(gòu)及線粒體自噬體變化情況

對(duì)照組（圖c-1、c-2）：肌纖維排列規(guī)律完整，無胞膜的破損，Z線清晰連續(xù)無斷裂，M線、明暗帶較清晰且區(qū)域明確，Z線附近可見到長(zhǎng)橢圓形的線粒體。

損傷后12 h 組（圖12h-1、12h-2）：由圖12h-1（×6000）可見，肌纖維大量斷裂、破損，排列凌亂，Z線完整性缺失，線粒體變圓、腫脹，甚至有空泡化表現(xiàn)；局部高倍（×50000）觀察，線粒體嵴模糊不清，出現(xiàn)線粒體自噬體，自噬體由膜結(jié)構(gòu)包裹和半包裹線粒體組成，有的被包裹線粒體內(nèi)部染色較深，少數(shù)被包裹線粒體內(nèi)部染色變淺呈現(xiàn)空泡狀，在單個(gè)網(wǎng)孔視野中即可見到多個(gè)自噬體。

傷后2 d 組（圖2d-1、2d-2）、5 d 組（圖5d-1、5d-2）、7 d 組（圖7d-1、7d-2）組：2～7 d 時(shí)腓腸肌超微結(jié)構(gòu)較為接近，表現(xiàn)為肌纖維斷裂仍然較多，但肌纖維的排列在傷后7 d組有明顯的改善，三組肌纖維的Z線仍有斷裂，線粒體數(shù)量明顯增多，但正常線粒體形態(tài)較少，線粒體腫脹、空泡仍明顯；局部高倍視野（×30000～70000）下可觀察到清晰的被膜包裹、半包裹的線粒體，單個(gè)網(wǎng)孔視野中即可見到數(shù)量較多的自噬體。

損傷后10 d 組（圖10d-1、10d-2）：肌纖維仍存在斷裂，但形態(tài)上排列趨于規(guī)則，破損胞膜逐漸修復(fù)，Z線仍不夠完整，有斷裂表現(xiàn)，但整體改善明顯；線粒體數(shù)量仍然多于正常對(duì)照組，且形態(tài)更多表現(xiàn)為橢圓形，但正常形態(tài)線粒體開始增多；提高放大倍數(shù)后（×10000）視野中可見較多被膜包裹的線粒體結(jié)構(gòu)，但自噬體數(shù)量比鈍挫傷后12 h～7 d組相比呈現(xiàn)減少趨勢(shì)。

傷后15 d（圖15d-1、15d-2）、30 d（30d-1、30d-2）：（×6000）肌纖維相對(duì)完整，15 d組雖然仍有少數(shù)斷裂肌纖維，但相鄰兩斷端之間有染色較深物質(zhì)填充，可能形成瘢痕，而30 d 組僅有少數(shù)肌纖維仍能看到斷裂端；肌纖維排列更加規(guī)整、有條理，Z線更加整齊完整；雖然仍存在一定數(shù)量的橢圓形線粒體，但正常形態(tài)線粒體增多接近正常對(duì)照組。高倍視野（×40000～50000）下，肌原纖維完整、清晰，排列較規(guī)整；但仍觀察到極少數(shù)被膜包裹、半包裹的線粒體，即自噬體的存在。

圖11 鈍挫傷后腓腸肌超微結(jié)構(gòu)及自噬體變化圖（×5000～70000）

3 討論

3.1 腓腸肌鈍挫傷對(duì)HIF-1α、AMPKα2、BNIP3、NIX 表達(dá)影響

骨骼肌鈍挫傷后肌組織被破壞，血管損壞、細(xì)胞破損、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性因子聚集、線粒體腫脹破壞等病理性改變，導(dǎo)致ATP生成障礙，AMP/ ATP 的比值升高誘發(fā)腫瘤抑制激酶LKB1-STRADα/β-MO25α/β復(fù)合物生成，激活缺氧應(yīng)激因子脯氨酸羥化酶（PHDs），從而激活A(yù)MPK[19，20]。而AMPK作為上游關(guān)鍵信號(hào)因子對(duì)誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子HIF-1促進(jìn)機(jī)體和細(xì)胞產(chǎn)生低氧適應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，因此鈍挫傷后AMPK表達(dá)可能與HIF-1表達(dá)出現(xiàn)同步[21，22]。本研究中，Hif-1α mRNA在傷后第二天表達(dá)出現(xiàn)峰值，與對(duì)照組有非常顯著性差異（P＜0.01），傷后第5天表達(dá)有下降趨勢(shì)，但仍較對(duì)照組有顯著升高（P＜0.05），傷后第7 天表達(dá)回落正常；而Ampkα 2 mRNA從傷后12 h表達(dá)較對(duì)照組有非常顯著的升高且達(dá)到峰值，該趨勢(shì)一直延續(xù)至傷后第2 天，傷后第5天表達(dá)雖顯著高于對(duì)照組，但表達(dá)卻呈下降趨勢(shì)，傷后第7天表達(dá)回歸正常水平至傷后30天。蛋白HIF-1α、AMPKα2表達(dá)折線圖趨勢(shì)說明12 h、2 d兩取材點(diǎn)為整個(gè)恢復(fù)過程中表達(dá)的峰值，傷后10 d，HIF-1α表達(dá)均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），傷后15 d后HIF-1α表達(dá)接近正常；而AMPKα2 僅在傷后5 d 表達(dá)仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），自傷后10 d 起，表達(dá)回歸至正常水平。我們的研究表明腓腸肌鈍挫傷恢復(fù)過程中，HIF-1α、AMPKα2變化趨勢(shì)同前人研究的組織病理變化具有一定關(guān)聯(lián)性[23，24]。在骨骼肌鈍挫傷恢復(fù)過程中，HIF-1α、AMPKα2 表達(dá)在傷后12 小時(shí)和2 天內(nèi)維持最高表達(dá)，說明此時(shí)是受損組織缺氧和能量障礙最為嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)期。之后，即第5天時(shí)，雖然二者的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，但已明顯下降，說明損傷5 天后，缺氧和能量障礙的狀態(tài)已緩解。至第7天，AMPKα2的表達(dá)恢復(fù)至正常水平，說明此時(shí)ATP 產(chǎn)生已趨于正常，而HIF-1α的表達(dá)是損傷后15天時(shí)趨于正常水平，說明傷后15天組織供氧已恢復(fù)。結(jié)合病理學(xué)，即鈍挫傷后5d，炎性浸潤(rùn)開始消退，新生血管開始向損傷組織內(nèi)長(zhǎng)入[23]，此時(shí)缺血缺氧有所改善，ATP 生成有所增加，HIF-1α、AMPKα2表達(dá)量開始下降。

BNIP3、NIX 是定位在線粒體外膜的、受缺氧誘導(dǎo)表達(dá)、參與線粒體自噬過程的一類基因。鈍挫傷誘發(fā)的缺氧導(dǎo)致了缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表達(dá)升高，誘發(fā)下游因子BNIP3、NIX的表達(dá)升高。隨著自體損傷修復(fù)進(jìn)行，局部改善損傷部位的缺氧環(huán)境，過表達(dá)的BNIP3和NIX通過介導(dǎo)線粒體內(nèi)溶酶體蛋白的沉積從而促進(jìn)線粒體完整性[25]，同時(shí)BNIP3和NIX可誘導(dǎo)線粒體自噬和細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18，26]，控制線粒體質(zhì)量，從而促進(jìn)鈍挫傷修復(fù)過程。我們的結(jié)果顯示：BNIP3、NIX 在骨骼肌鈍挫傷傷后恢復(fù)過程中，表達(dá)量的變化趨勢(shì)非常接近，在傷后12 h 即出現(xiàn)峰值。BNIP3 蛋白的表達(dá)自傷后5 d開始下降直至傷后10 d，但其間仍高于對(duì)照組，傷后15 d后回歸正常水平；NIX的表達(dá)于傷后5 d、7 d兩取材點(diǎn)仍高于正常，自傷后10 d開始至傷后30 d歸于對(duì)照；BNIP3、NIX 的mRNA 變化情況與其蛋白表現(xiàn)相符。本研究中，BNIP3、NIX的表達(dá)于傷后2天內(nèi)保持峰值，之后下降，直至10～15 天恢復(fù)至正常水平，這與HIF-1α的表達(dá)變化相一致，說明損傷后缺氧誘導(dǎo)了線粒體自噬的發(fā)生。傷后10～15天內(nèi)，機(jī)體完成了受損線粒體的清除，有效的對(duì)線粒體質(zhì)量進(jìn)行了控制。

3.2 鈍挫傷后自噬體發(fā)生與基因表達(dá)同步性分析

Fisher 等[27]早在1990 年就觀察并描述了骨骼肌鈍挫傷恢復(fù)過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化。本研究在前人研究基礎(chǔ)上重點(diǎn)對(duì)鈍挫傷后線粒體形態(tài)、數(shù)量、自噬體形成等進(jìn)行描述，發(fā)現(xiàn)12 h 后線粒體自噬體開始出現(xiàn)，傷后2 d、5 d、7 d 組線粒體數(shù)量明顯增多，但正常線粒體形態(tài)較少，線粒體腫脹、空泡仍明顯，單個(gè)網(wǎng)孔視野中即可見到數(shù)量較多的自噬體，說明在此期間線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)尚未完全恢復(fù)，線粒體仍處在自噬發(fā)生階段。損傷后10 d出現(xiàn)較多被膜包裹的線粒體結(jié)構(gòu)，說明線粒體結(jié)構(gòu)開始重建，自噬體數(shù)量趨于減少。

本研究結(jié)果顯示，鈍挫傷后線粒體自噬體在12 h～7 d 是線粒體自噬發(fā)生較為活躍的階段，這與前人的研究結(jié)果一致[28]。另外，結(jié)果顯示自噬體形成、發(fā)生與自噬相關(guān)蛋白BNIP3、NIX 的表達(dá)具有一定的同步性，即12 h～7 d期間BNIP3、NIX 表達(dá)明顯增高，說明線粒體自噬水平出現(xiàn)顯著提高，而電鏡結(jié)果印證了上述mRNA 和蛋白水平的結(jié)果。同時(shí)，HIF-1α、AMPKα2表達(dá)也顯著增高，說明鈍挫傷后炎癥浸潤(rùn)、局部血腫造成局部缺氧環(huán)境產(chǎn)生了骨骼肌能量代謝危機(jī)[25，29]。另外，BNIP3、NIX介導(dǎo)的線粒體自噬直接受到HIF-1α的調(diào)節(jié)，本研究結(jié)果HIF-1α、AMPKα2、BNIP3、NIX 表達(dá)增高說明在鈍挫傷發(fā)生后12 h～7 d局部ATP 產(chǎn)生不足，同時(shí)缺氧明顯，HIF-1α直接調(diào)控BNIP3、NIX 表達(dá)升高介導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生。在鈍挫傷修復(fù)過程中線粒體形態(tài)和數(shù)量在12 h～7 d 發(fā)生明顯改變，其機(jī)制可能是損傷后局部線粒體發(fā)生過程被激活。鈍挫傷發(fā)生后局部受損骨骼肌產(chǎn)生ATP 水平降低，導(dǎo)致AMPKα2高表達(dá)從而誘導(dǎo)線粒體發(fā)生[30，31]。因此，骨骼肌鈍挫傷后能量調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子AMPKα2、缺氧敏感因子HIF-1α、線粒體自噬誘導(dǎo)蛋白BNIP3、NIX表達(dá)均顯著增加，且呈現(xiàn)與時(shí)間相關(guān)的變化，間接反映了損傷后缺氧環(huán)境發(fā)生與改善，誘導(dǎo)線粒體自噬，清除破損細(xì)胞器、線粒體從而加速損傷部位線粒體重建，加速鈍挫傷的傷后恢復(fù)過程。

4 總結(jié)

（1）骨骼肌鈍挫傷發(fā)生后，損傷早期代謝調(diào)控因子AMPKα2、缺氧敏感因子HIF-1α 損傷變化情況表明損傷后受損骨骼肌內(nèi)部出現(xiàn)能量危機(jī)、并形成缺氧環(huán)境。另外，能量供應(yīng)的恢復(fù)要早于氧供應(yīng)的恢復(fù)。

（2）線粒體自噬、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子BNIP3、NIX表達(dá)變化表明損傷后線粒體自噬被啟動(dòng)，缺氧誘導(dǎo)了骨骼肌鈍挫傷早期的線粒體自噬。損傷后線粒體質(zhì)量控制的完成要遲于能量供應(yīng)的恢復(fù)，但與氧供應(yīng)的恢復(fù)基本同步。由此我們推測(cè)，鈍挫傷后有氧呼吸受阻，機(jī)體可能存在其他的能量供應(yīng)代償途徑。

（3）缺氧誘導(dǎo)的線粒體自噬可及時(shí)清除受損線粒體，維持線粒體質(zhì)量、為新生線粒體提供原料，從而減小損傷程度，以利于受損骨骼肌的快速恢復(fù)，這可能是損傷發(fā)生后機(jī)體的一種代償性機(jī)制。