呂媛媛，徐曼，張娟娟，管敏鑫

（1.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院，浙江 溫州 325027）

Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber's hereditary optic neuropathy，LHON）是一種母系遺傳病。1871年，德國眼科醫(yī)師Leber首次對其臨床特征作了相應描述:此病好發(fā)于青壯年男性，雙眼可表現(xiàn)同時或先后急性或亞急性無痛性視力減退，可能伴隨著中心視野缺失及色覺障礙[1-4]。典型的LHON首發(fā)癥狀是視物模糊，隨后的幾個月之內(nèi)出現(xiàn)無痛性、完全或接近完全的失明。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞退行性變是LHON的主要病理特性[5]。LHON和線粒體功能異常之間存在著密切關(guān)系，線粒體DNA的突變是這種疾病的分子基礎[2，6-7]。已報道，MT-ND1 3460G＞A、MT-ND1 11778G＞A和MT-ND1 14484T＞C突變存在于一些國家近90%的LHON家系當中，這3個LHON原發(fā)性位點參與編碼呼吸鏈復合體I的亞基[2，8]。但是，LHON相關(guān)的3 個原發(fā)性突變位點（m.3460G＞A、m.11778G＞A、m.14484T＞C）本身尚并不足以導致LHON的臨床表現(xiàn)。這也就合理地解釋了為什么在一個家系中或不同家系之間的母系親屬，盡管他們攜帶相同LHON相關(guān)的線粒體DNA突變，但視力損傷方面卻表現(xiàn)出不同的嚴重程度、發(fā)病年齡和外顯率。因此，其他的一些環(huán)境因素及遺傳因素（如核基因修飾、線粒體單體型等）可能參與LHON相關(guān)的線粒體DNA突變相關(guān)的視覺損害的表型表現(xiàn)的調(diào)節(jié)[2-3]。此外，LHON患者家系的典型特征是男性偏倚，而本研究的11個LHON家系僅累及了母系女性成員，這些女性成員表現(xiàn)出LHON的臨床特征。且對以上女性患者進行線粒體全基因組分析，鑒定她們的確攜帶線粒體ND4 11778G＞A突變。為探索其他環(huán)境因素或遺傳因素對LHON表型的影響，我們進一步對所有系譜中的母系成員進行線粒體全序分析及線粒體單體型分析。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2008年5月至2014年10月溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院、河北省眼科醫(yī)院、北京中醫(yī)藥大學東方眼科醫(yī)院、福建東南眼科醫(yī)院等全國各地多家醫(yī)院的LHON患者，采集他們的外周靜脈血液并收集相應的臨床資料。對收集的1 362例漢族LHON患者的MT-ND4基因進行了系統(tǒng)篩查，線粒體全基因組測序分析獲得11位攜帶11778G＞A突變的LHON患者，并對患者所在家系進行進一步測序分析。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學倫理委員會批準，所有受檢者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 眼科檢查:對收集的系譜中的先證者及其他成員進行眼科檢查，包括視力、視野、色覺檢查、眼底、壓力、瞳孔對光反射、視覺誘發(fā)電位、眼底成像等。根據(jù)WHO定義的視力損傷程度的標準:輕度（一級視力損傷）:0.3～0.1；中度（二級視力損傷）:0.1～0.05；重度（三級視力損傷）:0.05～0.02；極重度（四級視力損傷）:小于0.02。

1.2.2 線粒體基因組突變分析:從受檢者的外周靜脈血中提取基因組DNA（經(jīng)典酚氯仿手工法提?。崛〉幕蚪MDNA進行濃度和純度檢測（Nano Drop 2000，美國Thermo Fisher公司）。以提取的DNA作為PCR模板，按照PCR體系加入10×PCR buffer，dNTPs，正、反向引物，Mg2+，Taq酶，ddH2O各成分并混勻，置于PCR儀進行反應。設置反應程序為:95 ℃5 min，95 ℃ 45 s，Tm 59 ℃ 45 s，72 ℃1 min/kb，35個循環(huán)，72 ℃ 8 min。

11位先證者的線粒體基因組在一套輕（L）鏈和重（H）鏈寡核苷酸引物作用下在24個重疊片段中進行PCR擴增[9]。擴增產(chǎn)物進一步純化后用24對正反向引物進行線粒體基因組測序。最后，通過Codon Code序列分析軟件將測得的先證者的線粒體全序列與修正的mtDNA劍橋參考序列（Cambridge reference sequence，rCRS，NC_012920.1）[10]進行對比分析。

1.2.3 線粒體單體型分析:全序分析攜帶11778G＞A突變的11位先證者通過線粒體單體型命名法歸類到亞洲線粒體單體型[11-12]。

1.2.4 保守性分析:基因保守性是指某一段序列在進化演變的過程中，在不同的物種都一直保留。這樣的基因一定發(fā)揮著很重要的功能，并且有其不可代替性。因此為分析該位點的保守性，我們使用了17個脊椎動物的線粒體DNA序列來進行種間分析，包括小鼠、人、牛、節(jié)尾狐猴、卷尾猴、白手長臂猿、大猩猩、獼猴、地中海獼猴、倭黑猩猩、猩猩、蜂猴、蘇門答臘猩猩、阿拉伯狒狒、黑猩猩、馬來跗猴、爪蟾。通過對比人和其他16種脊椎動物的核苷酸變異計算得出該位點的保守性。即在17種脊椎動物中該位點具有野生型核苷酸的物種的百分比。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn) 先證者（WZ300-III-2、WZ327-IV-1、WZ415-IV-3、WZ883-IV-1、WZ1232-III-1、WZ1234-IV-3、WZ1245-III-1、WZ1391-III-1、WZ1420-III-1、WZ1427-III-6、WZ1448-II-3）分別在10、7、9、13、16、13、10、9、7、17、25歲時無痛性雙眼視力下降，先是單側(cè)視力下降，1～2周后對側(cè)視力下降，中心視野缺損，色覺障礙。對先證者們分別進行眼科檢查，視力損傷檢測結(jié)果見表1，患者發(fā)病時的視力損傷程度由輕度到極重度不等。個別視力損傷嚴重的患者眼底圖見圖1，家系圖見圖2。同時我們還對先證者所在家系成員進行臨床評估，先證者及其家系中患者皆為女性，發(fā)病年齡為9～26（12.4±4.8）歲；家系外顯率為6.7%～25.0%，每個家系平均15.90%±0.08%；11個家系合計總的外顯率為14.5%（見表2）。

表1 11例家系先證者臨床資料

圖1 3例患者和1名正常對照的眼底圖像

圖2 11例患者的家系圖

表2 11例家系患者臨床資料總結(jié)

進一步對11個家系中所有成員進行了全面的病史、體格檢查和眼科檢查，結(jié)果表明，這些家系先證者和其他成員并未表現(xiàn)出其他的臨床異常，如糖尿病、肌肉疾病、聽力障礙和神經(jīng)紊亂等臨床癥狀。因此，沒有其他相關(guān)證據(jù)或機制來影響家系中患者的視力損傷。

2.2 線粒體基因組分析 母系成員視力出現(xiàn)障礙會讓我們聯(lián)想到線粒體疾病，因為線粒體疾病的遺傳方式即母系遺傳。因此，我們通過提取血液DNA進行線粒體24對引物PCR擴增技術(shù)來對11位先證者進行線粒體全序檢測分析。首先檢測LHON相關(guān)的3個原發(fā)性位點（m.3460G＞A、m.11778G＞A、m.14484T＞C），結(jié)果發(fā)現(xiàn)11位先證者均攜帶了m.11778G＞A突變。通過對比先證者們的線粒體全序和修正的mtDNA劍橋參考序列[10]發(fā)現(xiàn):在這些先證者線粒體基因的核苷酸突變中，D-loop區(qū)有44個變異；12S rRNA編碼區(qū)有5個變異；16S rRNA編碼區(qū)有3個變異；tRNAGln、tRNAMet、tRNAAla、tRNACys、tRNAGlu編碼區(qū)各1個變異；NC非編碼區(qū)1個變異；氨基酸編碼區(qū)95個變異（其中同義突變69個，錯義突變26個），共計153個變異位點。此外，我們還針對發(fā)現(xiàn)的突變位點進行保守性評估，對其他16種脊椎動物中的這些序列和變異點進行系統(tǒng)進化分析，進一步評估這些RNA和編碼區(qū)中的變異點，通過人與其他16種脊椎動物的核苷酸變異進行比較計算出該位點的保守性指數(shù)。RNA上的變異點及保守性見表3，氨基酸編碼區(qū)的錯義突變位點及保守性見表4。

表3 D-loop區(qū)及RNA上變異位點總結(jié)

2.3 線粒體單倍體型分析 線粒體DNA與核基因不同，首先線粒體DNA缺乏組蛋白保護而呈現(xiàn)裸露的閉合雙環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使其易被損傷；同時線粒體是呼吸重要場所，處于高超氧化物的環(huán)境下更易受到損傷；并且缺乏有效DNA修復機制，修復能力非常有限[13]。線粒體DNA突變隨著放射狀母系而積累。當線粒體DNA獲得功能性的突變有益于在特定環(huán)境中生存，于是這種線粒體DNA得到選擇性的富集，并在這樣的環(huán)境中形成了一組線粒體DNA單體型相關(guān)的群體，被稱為單倍群[14]。它們組成了線粒體多態(tài)樹的主要分支，并以發(fā)現(xiàn)的先后對照字母的順序命名（A到Z）[15]。本研究的11個家系的先證者分別屬亞洲線粒體單體型B5a、Z、N9、B4c1b、G2h、B5a、M7b、N9a10、C7b、M7b1和M10。

3 討論

本研究對11個LHON家系的臨床、遺傳、分子特征進行了詳細地研究。視神經(jīng)病變?yōu)槲ㄒ坏呐R床表型僅存在于攜帶相同質(zhì)性MT-ND4 11778G＞A突變家系的母系成員中，說明線粒體基因突變是該病的分子基礎。而此處令人驚訝的是11個家系中共有18人出現(xiàn)視神經(jīng)性病變，而這18位患者皆為女性。這一現(xiàn)象與德國眼科醫(yī)師Leber對LHON所作出的臨床特征描述—偏倚青壯年男性[1-4]有所不符。而且，我們可以看到11 個家系中患者的發(fā)病年齡和發(fā)病時視力損傷程度及外顯率都相差較大，雖然這些患者都有快速、無痛、雙側(cè)中樞視力喪失的共同的特點。家系內(nèi)（數(shù)據(jù)未展示）和家系間的母系親屬表型變異范圍廣泛，包括嚴重程度、發(fā)病年齡和視力障礙外顯率等，表明在LHON相關(guān)的m.11778G＞A突變表型表現(xiàn)中涉及到其他修飾因子（包括核修飾因子、線粒體單倍型、表觀遺傳和環(huán)境因素）的參與。早在之前的報道中就有提及LHON的男性優(yōu)勢、外顯率較低、女性發(fā)病較遲等幾個線粒體遺傳而無法解釋的特點[16]。因為男性高度偏倚使得X染色體連鎖和線粒體基因被緊密聯(lián)系在一起[16-18]。有學者曾提出假說:認為LHON這種疾病可能是X基因與線粒體DNA缺陷相互作用的結(jié)果[18]。HUDSON等[19]則定義了一個X染色體單倍體與特定的MTND突變相互作用，導致最常見的mtDNA疾病LHON的視力損傷。因此，我們也可以確定這11個家系中的母系女性患者的發(fā)病也涉及其他修飾因子的參與。

表4 蛋白編碼區(qū)變異位點總結(jié)

在諸多修飾因子中，線粒體單倍體型也曾被提及與LHON有著一定的聯(lián)系。線粒體單倍體型A、B、F、J1、J2、M、M7B1'2、M10a有增加LHON的風險，而線粒體單體型H和M8a則扮演著“保護因子”的角色[15，20]。其中，在意大利人群中單體型J（一種歐洲人特異單體型）有增加m.11778G＞A和m.14484T＞C突變的傾向。反過來，在單體型J上發(fā)生m.11778G＞A或（和）m.14484T＞C突變會增加LHON的外顯率[21]。并且線粒體單體型J不同的亞型在LHON表達中發(fā)揮作用不同，單體型J2會增加m.11778G＞A突變攜帶者視力損傷的風險率，而單體型J1則會增加m.14484T＞C突變攜帶者的視力損傷的風險率。單體型H作為“保護因子”可以降低m.11778G＞A突變攜帶者的LHON外顯率[20，22]。本研究11個家系先證者的單體型分別為B5a、Z、N9、B4c1b、G2h、B5a、M7b、N9a10、C7b、M7b1、M10，都屬于亞洲人群的單體型。雖然，其他線粒體單體型（除J單體型）目前并沒有報道與m.11778G＞A突變有較為強烈的偏向性，但也不排除其他線粒體單體型對攜帶m.11778G＞A突變的患者表型變異（包括嚴重程度、發(fā)病年齡和視力障礙外顯率等）存在一定的影響。

當然，除了線粒體單體型外，11個家系中的患者表型差異也可能與其不良的生活習慣（抽煙、酗酒、吸毒等）、工作壓力和精神狀態(tài)（抑郁、孤僻等）等環(huán)境因素相關(guān)[23-24]；另外，也不排除患者的核基因修飾[19，25-26]或繼發(fā)性位點突變也在LHON的生理病理過程中發(fā)揮了相應的作用。

綜上所述，線粒體基因突變相關(guān)的LHON是一種多因素疾病，單純的原發(fā)性位點（m.3640G＞A、m.11778G＞A、m.14484T＞C）突變并不一定會引起視力損傷的臨床癥狀（即LHON的不完全外顯性），但原發(fā)性位點突變是視神經(jīng)萎縮的一個危險因素[27]。伴隨著核基因修飾、特異性線粒體單倍體型、不良生活環(huán)境或繼發(fā)性突變位點的相互作用就有可能會增加LHON的外顯率。