朱鈞一 唐清明 陳莉莉 賈玉林

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，其5 年總體生存率約為60%左右[1]。盡管綜合序列治療有效提高了口腔鱗癌的局部控制率，但臨床晚期的口腔鱗癌患者生存率仍無明顯改善。近年來，隨著腫瘤基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，分子靶向治療為口腔鱗狀治療提供了新的思路。Axl 激酶屬于受體酪氨酸激酶TAM家族，能與配體Gas 6結(jié)合而激活其酪氨酸激酶活性，進(jìn)而活化其下游的信號通路，與腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移等惡性行為密切相關(guān)[2]。近來研究發(fā)現(xiàn)，Axl在口腔鱗癌中高表達(dá)，且有望成為口腔鱗癌新的分子治療靶點(diǎn)[3]。

自噬是真核細(xì)胞降解受損細(xì)胞器或蛋白，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的高度保守的生物學(xué)過程，在多種生理病理學(xué)過程中起著重要作用[4]。自噬與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要關(guān)系，并且為腫瘤治療提供了新思路，是目前國際上腫瘤研究中的熱點(diǎn)。目前關(guān)于靶向Axl對于腫瘤細(xì)胞自噬的研究尚未見報道。本研究選取口腔鱗癌細(xì)胞系Cal27為研究對象，探究Axl特異性分子抑制劑R428對口腔鱗癌細(xì)胞系細(xì)胞活力的影響，并進(jìn)一步研究R428誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞的自噬現(xiàn)象，及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 口腔鱗癌細(xì)胞系Cal27(ATCC， 美國)， Cal27細(xì)胞使用含有10%胎牛血清(Gibco，美國)和1%青霉素-鏈霉素(Hyclone，美國)的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，美國)培養(yǎng)，隔天換液，每隔3 天傳代1 次，細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃和5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.1.2 主要試劑 Axl抑制劑R428(Selleck，美國)；自噬抑制劑3-MA(Selleck，美國)；自噬抑制劑CQ、 活性氧清除試劑NAC、 MTT、 DMSO、 G418(Sigma，美國)； 細(xì)胞蛋白裂解液RIPA(上海碧云天)；BCA蛋白定量試劑盒(上?？党缮?；DNA轉(zhuǎn)染試劑(Biotool, 上海)；活性氧檢測試劑盒(Solarbio， 北京)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定細(xì)胞活力 收集對數(shù)期Cal27細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為50 000 個/ml，在96孔板中每孔加入100 μl細(xì)胞懸液(每孔5 000 個細(xì)胞)，接種細(xì)胞后12 h(此時Cal27細(xì)胞已良好貼壁)使用不同濃度的藥物處理Cal27細(xì)胞24 h。 24 h后去除原有培養(yǎng)基并加入含10% MTT的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后，去除培養(yǎng)液后加入DMSO溶解紫色結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀讀取570 nm吸光度并計算細(xì)胞活力。

1.2.2 透射電鏡 收集的細(xì)胞團(tuán)塊經(jīng)2.5%戊二醛固定過夜， 1% OsO4處理后入梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切成65 nm超薄切片， 2%醋酸鈾酰染色， Hitachi H-600型透射電鏡觀察。

1.2.3 GFP-LC3免疫熒光檢測 使用DNA轉(zhuǎn)染試劑將GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Cal27細(xì)胞后，利用G418篩選細(xì)胞。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，使用PBS清洗細(xì)胞兩遍，更換為新鮮DMEM培養(yǎng)基做進(jìn)一步處理。使用熒光顯微鏡觀察Cal27細(xì)胞的LC3熒光，按照先前文獻(xiàn)記載方法對細(xì)胞的LC3熒光點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計[5]。

1.2.4 Western Blot Cal27細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿，按實(shí)驗分組處理24 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4 ℃ 過夜孵育、二抗室溫1 h孵育等過程后，顯影成像分析。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測 將細(xì)胞接種于24 孔板中，完成加藥處理細(xì)胞后，加入活性氧檢測試劑盒中的DCFH-DA熒光探針， 37 ℃孵育30 min后，PBS洗滌細(xì)胞3 次， 加入新鮮培養(yǎng)基，放入熒光酶標(biāo)儀中進(jìn)行熒光檢測[6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Axl抑制劑R428對Cal27細(xì)胞活力的影響

MTT細(xì)胞活力實(shí)驗結(jié)果表明，Axl抑制劑R428處理口腔鱗癌Cal27細(xì)胞24 h后能顯著降低其細(xì)胞活力，且R428對Cal27細(xì)胞的殺傷作用呈劑量依賴性(圖 1)。R428的半抑制藥物濃度(IC50)為1.317 μmol/L，后續(xù)實(shí)驗選擇0.5、 1、 1.5 μmol/L作為R428的藥物作用濃度。

圖 1 不同濃度的R428對Cal27細(xì)胞活力的影響

2.2 Axl抑制劑R428對Cal27細(xì)胞自噬活動的影響

結(jié)果表明，與對照組相比(圖 2A)，R428處理組的細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)出自噬泡(autophagic vacuoles)累積(圖 2B)，自噬泡體積較大，占據(jù)了細(xì)胞質(zhì)大量空間(圖 2B)，且自噬泡內(nèi)有較多細(xì)胞內(nèi)容物(圖 2C)。R428處理Cal27細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的GFP-LC3熒光點(diǎn)數(shù)目明顯增多(圖 3)，且GFP-LC3的熒光增多效應(yīng)與R428藥物作用濃度呈正相關(guān)(圖 4)。Western blot實(shí)驗表明，R428能夠劑量依賴性地引起Cal27細(xì)胞中Atg5(自噬正向調(diào)控分子)的表達(dá)升高和P62(自噬底物)的表達(dá)降低(圖 5)。這些結(jié)果均表明Axl抑制劑R428能夠?qū)е翪al27細(xì)胞自噬水平升高。

2.3 R428誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對Cal27細(xì)胞活力的影響

實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，與R428單獨(dú)處理Cal27相比(1 μmol/L R428處理Cal27細(xì)胞24 h)，使用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理(4 mmol/L 3-MA預(yù)處理細(xì)胞1 h)Cal27后其細(xì)胞活力明顯降低(圖 6)。與此同時， 使用另一種抑制劑CQ阻斷自噬(10 μmol/L CQ預(yù)處理細(xì)胞1 h)也能夠增強(qiáng)R428對Cal27的細(xì)胞殺傷作用(圖 6)。

圖 2 Cal27細(xì)胞自噬

(TEM， A、 B: ×1 500， C： ×3 000)

Fig 2 Autophagy of Cal27 cells

(TEM， A, B: ×1 500， C： ×3 000)

圖 3 Cal27細(xì)胞自噬

(免疫熒光顯微鏡, ×40)

Fig 3 Autophagy of Cal27 cells

(IFM, ×40)

圖 4 Cal27細(xì)胞內(nèi)LC3熒光點(diǎn)數(shù)目 圖 5 R428對Cal27細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig 4 LC3 fluorecent plot in Cal27 cells Fig 5 Autophagy related protein expression of Cal27 cells

2.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧在R428誘導(dǎo)的Cal27細(xì)胞自噬中的作用

細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)與自噬關(guān)系密切而復(fù)雜。本研究結(jié)果表明，Axl抑制劑R428能顯著升高Cal27細(xì)胞內(nèi)ROS水平，且R428對ROS的刺激作用呈濃度依賴性(圖 7)。使用活性氧清除試劑NAC來降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平， 結(jié)果表明，NAC不僅能有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平(圖 7)，而且能夠顯著抑制R428誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)LC3熒光聚集，表明NAC能夠抑制R428誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬(圖 7)。此外， R428單獨(dú)作用能有效殺傷Cal27細(xì)胞，而活性氧清除試劑NAC與R428聯(lián)合作用能進(jìn)一步增強(qiáng)其細(xì)胞殺傷效果(圖 7)。這些結(jié)果提示ROS對R428誘導(dǎo)的Cal27細(xì)胞自噬發(fā)揮促進(jìn)作用。

3 討 論

口腔鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度較高，生長快，浸潤性強(qiáng)， 容易沿頸部淋巴結(jié)途徑轉(zhuǎn)移，晚期口腔鱗癌患者常因局部復(fù)發(fā)和頸部淋巴結(jié)及全身轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致死亡[7]?；熥鳛槟壳皬V泛應(yīng)用于口腔鱗癌手術(shù)前后的重要輔助治療，是口腔鱗癌綜合序列治療的重要環(huán)節(jié)。隨著腫瘤細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步，分子靶向治療在口腔鱗癌治療中的價值和意義逐漸凸顯出來，成為未來臨床治療發(fā)展的重要突破方向[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Axl 激酶作為受體酪氨酸激酶 TAM 家族的一員，在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和耐藥性等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，有望成為惡性腫瘤治療一個新的分子靶點(diǎn)[9]。與此同時，研究表明Axl不僅在口腔鱗癌中表達(dá)明顯升高，且體外細(xì)胞實(shí)驗和人源性腫瘤組織異種移植實(shí)驗均證實(shí)針對Axl的分子靶向藥物在口腔鱗癌治療中具有重要價值[3]。R428作為Axl的一種特異性抑制劑，能夠阻斷Axl的催化和促癌活性，是目前研制出針對Axl最有效的分子靶向藥物之一[10]。然而，Axl抑制劑R428用于口腔鱗癌治療的作用機(jī)制較為復(fù)雜，其藥理機(jī)制仍不明確。

圖 6 R428誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對Cal27細(xì)胞活力的影響

Fig 6 The effects of R428-induced autophagy on the viability of Cal27 cells

圖 7 細(xì)胞內(nèi)活性氧在R428誘導(dǎo)的Cal27細(xì)胞自噬中的作用(與空白對照組相比，①P<0.01，②P<0.001; 與R428單獨(dú)處理組相比, ③P<0.001)

Fig 7 The role of intracellular ROS in R428-induced autophagy of Cal27 cells (versus the blank group，①P<0.01，②P<0.001； versus the R428 treatment group, ③P<0.001)

自噬是真核細(xì)胞普遍存在的生命現(xiàn)象。在自噬過程中，細(xì)胞通過形成雙層膜樣結(jié)構(gòu)包裹受損或變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器形成自噬體，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后通過溶酶體降解其所包裹的內(nèi)容物并加以回收利用，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和能量代謝的平衡[4]。大量研究表明，自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及放化療抵抗中亦扮演著至關(guān)重要的角色[11]。在藥物作用等應(yīng)激條件下，自噬通常具有“兩面性”特征：在一些情況下(如DNA損傷或它莫西芬等抗激素藥物作用)自噬可以發(fā)揮促生存作用，抑制細(xì)胞死亡，而在另一些情況下(如Bcl-2或PKC蛋白抑制劑作用)，自噬可以發(fā)揮促死亡作用，引起自噬性細(xì)胞死亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Axl抑制劑R428作用于口腔鱗癌Cal27細(xì)胞后，能明顯抑制其細(xì)胞活力，導(dǎo)致細(xì)胞死亡； 借助透射電鏡、LC3免疫熒光和Western blot多種檢測手段，發(fā)現(xiàn)R428在誘導(dǎo)Cal27細(xì)胞死亡的同時，還可以顯著升高Cal27的細(xì)胞自噬水平，這表明R428對Cal27細(xì)胞具有促自噬作用。為了探究R428誘導(dǎo)的自噬對Cal27細(xì)胞存亡的作用，本研究使用2 種常用抑制劑阻斷了Cal27細(xì)胞自噬，結(jié)果表明抑制細(xì)胞自噬可增強(qiáng)R428對口腔鱗癌細(xì)胞的殺傷作用，這提示聯(lián)合應(yīng)用R428和自噬抑制藥物可能成為Axl分子靶向治療的新策略，增強(qiáng)其對口腔鱗癌的抗腫瘤作用。

細(xì)胞內(nèi)ROS是機(jī)體內(nèi)有氧代謝產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱，能夠調(diào)控多種細(xì)胞生理和病理反應(yīng)，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要作用[13]。近年來一系列研究表明，細(xì)胞內(nèi)ROS可作為一種細(xì)胞內(nèi)信號分子參與細(xì)胞自噬的激活[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，R428能夠升高Cal27細(xì)胞內(nèi)ROS水平。進(jìn)一步研究表明，使用活性氧清除試劑NAC阻斷細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生后，R428誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平明顯降低，且細(xì)胞活力亦明顯降低，這提示細(xì)胞內(nèi)ROS可能是R428誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬信號通路中的一個正向調(diào)控信號分子(圖 8)。綜合R428對Cal27細(xì)胞的效應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)R428在誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞死亡的同時，還可以激活口腔鱗癌細(xì)胞的防御反應(yīng)——細(xì)胞自噬，而細(xì)胞內(nèi)ROS對自噬發(fā)揮正向調(diào)控作用(圖 8)。

圖 8 R428誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬作用示意圖

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)Axl抑制劑R428可同時誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞死亡和細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞自噬可增強(qiáng)R428對口腔鱗癌細(xì)胞的殺傷作用，針對Axl的分子靶向藥物R428有望成為口腔鱗癌新的治療選擇。