王璐 張洲銘 金諾 蔡卜磊 董廣毅 李德超

通過組織工程骨進行牙槽骨的修復再生實質是由再生與血管化2 個方向共同調節(jié)的。在此期間，如果血管再生不充分會導致新生組織內部營養(yǎng)缺乏，從而導致組織吸收甚至感染[1]。尤其是當缺損面積較大或組織再生能力差時，組織中新血管的形成和穩(wěn)定更加重要。

血管網絡的建立需要多種細胞因子的調節(jié),如血小板衍生生長因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)，血管生成素(Angiopoietin-1，Ang-1)等[2-3]。通過聯(lián)合使用多個生長因子可以在一定程度上促進組織內的血管再生，但是這種外源性直接干預會打破血管重建平衡從而導致大量不成熟的血管形成而造成血管高壓進一步發(fā)生血管微滲漏[4-5]。miRNA長約21～23 個核苷酸，是一種內源性產生的單鏈非編碼RNA分子，具有高度的保守性和高組織表達特異性。miRNA的過度表達或抑制可同時調節(jié)多種生長因子的內源性表達，目前已發(fā)現(xiàn)某些miRNA可以通過間接誘導細胞產生多種血管生成相關因子來促進血管的形成和成熟[6]，為組織工程材料內部血管化提供了新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為SPF級4～6 周齡C57 裸鼠，雄性，體質量 18～25 g[空軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院(原第四軍醫(yī)大學)實驗動物中心]。

1.2 主要試劑與儀器

α-MEM(12561-056， Gibco，美國)； 胎牛血清、 2.5 g/L胰酶細胞消化液(Hyclone公司， 美國)； E.Z.N.A.?Total RNA Kit I(OMEGA公司，美國)； Prime ScriptTMRT-PCR Kit、 SYBR?Premix Ex TaqTM(Takara公司， 日本)； Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR(廣東Ruibo 公司)； pEGFP-N1-miR126、 lipofectamine 3000 Transfection Kit(L3000-001， Invitrogen公司， 美國)；PVDF(500-600， BIO-RAD， 美國)； G418(Sigma公司， 美國)；CD31(abcam公司， 美國)； Matrigel(Corning公司，美國)；超凈工作臺(Forma公司，美國)； CO2恒溫孵育箱、 酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo公司，美國)； 共聚焦熒光顯微鏡 (Olympus Optical公司，日本)； Real-time RT-PCR 儀(Applied Biosystems公司, 美國)。

1.3 人臍靜脈血管內皮細胞(humanumbilical vein endothelial cells, HUVECs)的分離和培養(yǎng)

無菌條件收集采自空軍軍醫(yī)大學(原第四軍醫(yī)大學)西京醫(yī)院婦產科新生兒臍帶(本研究得到西京醫(yī)院倫理委員會同意并取得了產婦的知情同意)，將取來的臍帶立即移入超凈工作臺，在無菌條件下，吸取無菌生理鹽水從臍帶一端插入臍靜脈沖洗至沖洗清亮，注入胰蛋白酶消化數(shù)分鐘，消化完畢后，松開固定端，將消化液收集到盛有10% α-MEM培養(yǎng)基的15 ml離心管中，吹打均勻后1 500 r/min離心5 min，棄上清；接種于培養(yǎng)皿中，細胞傳代至第3 代用于實驗。

1.4 細胞miRNA的轉染

取對數(shù)生長期為第3 代的HUVEC，按照 lipofectamine 3000 Transfection Kit說明書進行操作。將HUVEC細胞以1×106個/ml細胞密度接種于六孔板中；miR-126序列如下：5′-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-3′，同時設置對照序列。轉染72 h后開始用400 μg/ml的G418選擇培養(yǎng)液進行篩選，每3 天換液1 次， 1 周后更換為200 μg/ml的G418選擇培養(yǎng)液篩選6 周后收集細胞進行實驗。

1.5 miRNA轉染效率和效果驗證

1.5.1 熒光半定量觀察 細胞轉染24 h之后，用PBS沖洗2～3 次，4%多聚甲醛固定1 h， PBS洗滌2～3 次，用DAPI室溫染色，吸除染色液，PBS洗滌2～3 次，抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察紅色熒光顯色情況，鏡下計數(shù)10 個40 倍視野發(fā)紅色熒光的細胞數(shù)占總細胞的百分率作為轉染效率的近似值。

1.5.2 miRNA表達的檢測 轉染24 h后按照E.Z.N.A.?Total RNA Kit I說明書分組提取細胞總RNA，酶標儀檢測RNA濃度，每個標本抽取等量的RNA進行RT-PCR檢測提按照Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進行操作。反轉錄反應條件： 37 ℃、 15 min； 85 ℃、5 s；-20 ℃保存?zhèn)溆谩?Rt-PRC 反應條件： 95 ℃、 10 min； 95 ℃、 2 s； 60 ℃、 20 s； 70 ℃、 10 s； 40 個循環(huán)。

1.6 miRNA成血管相關基因和蛋白的檢測

1.6.1 RT-PCR 檢測 通過 RT-PCR方法檢測miR-126表達的變化對成血管相關基因Vegf 和 Ang1的表達的影響。反轉錄反應條件： 37 ℃、 15 min； 85 ℃、 5 s； -20 ℃保存?zhèn)溆?。Rt-PRC 反應條件： 95 ℃、 30 min； 95 ℃、 5 s， 60 ℃、 34 s， 95 ℃、 15 s， 60 ℃、 1 min、 95 ℃、 15 s； 40 個循環(huán)，GAPDH作為內參。各組引物由Takara生物科技公司合成，各引物序列(表 1)。

表 1 RT-PCR引物及其序列

Tab 1 RT-PCR primers and their sequences

1.6.2 Western blot蛋白印跡檢測 通過Western blot蛋白印跡方法檢測miR-126對成血管相關蛋白Vegf、 Ang1的表達的影響，將HUVEC接種在6 孔板中，細胞密度為1×106個/ml，轉染步驟同上， 24 h后檢測，按照說明書MinuteTMTotal Protein Extraction Kit(Invent公司， 美國)進行細胞總蛋白提取。轉染后 37 ℃、 5% CO2孵箱至第14 天，裂解細胞，按照BCA法測量蛋白濃度，上樣。通過 SDS-PAGE 凝膠電泳，安裝電泳槽及電源，PVDF膜轉膜后，孵育一抗， 4 ℃過夜，1%TBST洗滌3 次每次5 min，室溫孵育二抗， 1 h后1% TBST洗滌3 次每次5 min后使用 Thermo 公司發(fā)光液、顯影。以下是使用的抗體稀釋比例: Vegf 1∶500， Ang-1 1∶500， β-acting 1∶1 000。 IMAGE-J軟件分析條帶的灰度值。

1.7 Matrigel成管實驗

將 Matrigel 預先放置于4 ℃冰箱過夜，溶膠，實驗開始前將接觸到Matrigel槍頭、離心管、 96 孔板、培養(yǎng)液等均放在4 ℃冰箱預冷，取出 Matrigel移至超凈臺內在冰上操作，混勻Matrigel基質，按每孔吸取 10 μl 加入96 孔板中， 37 ℃孵育45 min， 將轉染miR-126和miR-NC的HUVEC胰蛋白酶消化2 min， 離心5 min， PBS清洗2 遍， 用完全培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度每孔按1×105個細胞接種，放回孵箱培養(yǎng)24 h，后激光共聚焦觀察成管效果。

1.8 細胞免疫熒光染色

CD31對成管進行染色，PBS清洗細胞2 次， 4%多聚甲醛固定1 h， 用含0.2%Tritonx-100的PBS透化5 min， 含3%FBS的PBS清洗細胞3 次， 含3% FBS和0.5% Teween20封閉1 h， 一抗(CD31按1∶500稀釋)室溫封閉1 h， PBS清洗細胞3 次， 熒光二抗(1∶500稀釋)室溫孵育30 min， PBS清洗3 次，防熒光催化劑封片，后激光共聚焦觀察成管效果。

1.9 體內血管形成實驗

將Matrigel 預先置于4 ℃冰箱過夜，溶膠400 μl，將107個細胞(miR-126與miR-NC轉染后)混勻于膠中(全程冰上操作)。將裸鼠麻醉后，無菌條件下，老鼠背部皮下注射400 μl基質膠細胞混合物， 7 d后取材， 10%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、烤片； CD31免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 miR-126 過表達及轉染效率驗證

通過激光共聚焦結合real time RT-PCR 分析比較miRNA轉染效率與效果(圖 1A)。 miR-126轉染(圖 1B)HUVEC后RT-PCR結果顯示， miR-126/HUVEC組與miR-NC/HUVEC組(1.00±0.1)相比較， miR-126相對表達水平為(7.88±1.1)， miR-126/HUVEC組miR-126表達量顯著高于miR-NC/HUVEC組，差異具有統(tǒng)計學意義。

A: 激光共聚焦顯微鏡觀察(×200)； B： miR-126在HUVECs內的表達(n=3)

圖 1 miR-126在HUVECs中的轉染效率

A: Laser confocal microscopy observation(×200); B: miR-126 expression in HUVECs(n=3)

Fig 1 miR-126 transfection efficiency into HUVECs

2.2 miR-126促進HUVEC成血管關鍵生長因子的表達

通過real time RT-PCR 和Western blot 比較分析成血管相關基因的表達， miR-126轉染HUVEC后RT-PCR結果顯示，miR-126過表達有效的促進了胞內 VEGF；ANG-1的RNA(圖 2A)和蛋白(圖 2B)的表達。

2.3 miR-126促進了血管內皮細胞的管腔形成

體外Matrigel 管腔形成實驗結果顯示，miR-126/HUVEC 組有明顯的環(huán)形管狀似血管結構，端端可見接觸，管壁形態(tài)完整，miR-NC/HUVEC組未見明顯端端接觸和環(huán)形管狀結構且管狀結構不完整(圖 3)。

2.4 miR-126體內促進了血管化

基于體內異位成血管的模型，通過對血管內皮細胞標志物CD31免疫熒光染色顯示，miR-126在HUVEC的過表達有效的促進了其在體內的血管再生。miR-126/HUVEC組中 CD31陽性細胞含量明顯高于miR-NC/HUVEC 組，說明miR-126能夠有效促進體內微血管的形成(圖 4)。

3 討 論

局部微血管的新生對于牙槽骨缺損的再生修復具有重要意義，穩(wěn)定新血管的生成需要血小板衍生生長因子(PDGF)，轉化生長因子b(TGF-b)和血管生成素1(Ang1)等關鍵生長因子[7-9]，但因子遞送方式和時間是刺激新生血管形成和成熟的關鍵[10]。盡管遞送生長因子可以促進血管生成，但過量遞送單一生長因子所生成的血管通常都是不成熟血管和，極易發(fā)生微滲漏。因此，新生血管的成熟穩(wěn)定需要多個生長因子作用并同時嚴格控制遞送生長因子的劑量。

圖 2 VEGF和ANG-1 mRNA在HUVECs中的表達

Fig 2 The expression of mRNA and protein of VEGF and ANG-1 in HUVECs

圖 3 HUVECs的管腔形成(n=3)

(×50)

Fig 3 Lumen formation of HUVECs

(×50)

圖 4 HUVECs 體內血管化(綠色： CD31； 藍色： DAPI)

(×200)

Fig 4 The vascularization of HUVECsinvivo(Green: CD31; Blue: DAPI)

(×200)

miRNA可以同時靶向多個mRNA[11-12]，過度表達或抑制多個特定miRNA，從而同時調節(jié)多種生長因子的內源性表達。在血管生物學領域中，已發(fā)現(xiàn)多個可以調節(jié)血管生成的miRNA。據(jù)報道，miRNA如miR-93， miR-214及miR-221/22等能夠通過調節(jié)血管內皮細胞進而促血管生成或抗血管生成[13]。又有研究表明腫瘤細胞中miR-21和miR-29b的過度表達通過上調血管生成生長因子如HIF-1a和VEGF來誘導血管生成[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦微血管內皮細胞(BMECs)中敲除miR-126-3后，細胞內PIK3R2表達上調，進而使血管內皮生長因子(VEGF)逆轉、血管生成素-1(Ang-1)誘導的Akt活化和BMEC凋亡的抑制[15-17]。而本研究發(fā)現(xiàn)HUVEC轉染miR-126后可顯著提高成血管相關基因VEGF和Ang1的表達，而且體外成管實驗也發(fā)現(xiàn)miR-126的過表達可促進血管的形成并且提高血管完整性。體內實驗也證實了miR-126的過表達明顯促進了體內血管網的形成以及成熟。

近年來，組織工程骨在牙槽骨缺損的治療中取得了重大突破，但組織工程骨內的血管網絡建立仍是大范圍骨缺損修復的難點所在。本次實驗發(fā)現(xiàn)，miR-126能夠同時促進成多種血管相關基因的表達與分泌，進而促進血管的再生和成熟，為組織工程骨內的血管網絡建立提供了新的治療策略。