趙 倩， 楊 亮， 朱麗萍

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科一病區(qū), 烏魯木齊 830011)

乳腺癌的發(fā)病率不斷增長，成為全球發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤之一[1]，嚴重危及女性健康。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt，不編碼蛋白的RNA，這類RNA起初被認為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”[2]。隨著2017年HOTAIR功能被發(fā)掘，lncRNA的功能漸漸明確。lncRNA常常與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和細胞生長有關(guān)，其表達量的異常及功能的變化能夠明顯影響多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程[3-4]。在癌癥中，lncRNA可以作為癌基因和抑癌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子，如過表達的lncRNA HOTAIR與乳腺癌[5]、結(jié)腸癌[6]和肝癌[7]有關(guān)，即lncRNA TARID可以預(yù)防癌癥形成，通過甲基化抑癌基因的表達。Yan等[8]報道顯示，lncRNA ITGB1在乳腺癌中發(fā)揮癌基因作用，促進乳腺癌細胞的遷移和擴增，但其在乳腺癌組織中的表達和臨床意義，相關(guān)研究報道較少。本研究旨在探討lncRNA ITGB1在乳腺癌及癌旁組織中的表達水平，以及與臨床病理特征的相關(guān)性，為下一步尋找靶點基因提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本資料選擇2017年1月-2018年12月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科一病區(qū)經(jīng)病理確診的90例乳腺癌患者。所有患者術(shù)前未接受放化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療，術(shù)后病理確診為乳腺癌，排除既往有惡性腫瘤病史、乳腺轉(zhuǎn)移性癌。收集90例患者乳腺癌組織(病理類型為原發(fā)性浸潤性癌)及配對癌旁組織(取自腫瘤組織>5 cm的乳腺正常組織)。標(biāo)本迅速放入液氮中冷凍，并保存在-80℃冰箱中，用于RNA的提取。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和實驗儀器RNA提取試劑，TRIzolTMReagent(Ivitrogen，CA，美國)，DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。熒光定量PCR儀：羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，上海，型號：IQ5，電熱恒溫箱：汗諾儀器有限公司，上海，型號：DHP-42，立式壓力蒸汽滅菌器：博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，上海，型號：YXQ-LS-3011，濕熱滅菌器：SANYO公司，日本，型號：MLS-3750，瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一生物科技有限公司，DYCP-31BN型)，nanodrop1000微量紫外可見分光光度計(Thermo)。

1.3 總RNA的提取對所有乳腺癌及癌旁組織標(biāo)本切除后置于液氮中保存，各樣本均取50～100 ng置于1.5 mL離心管中，加入1 mL TRIzol試劑，研磨5～10 min，使用TRIZD1試劑提取乳腺癌組織及癌旁組織樣本中總RNA，分光光度計上檢測各樣本總RNA的濃度及純度(A260/A280 nm)，選用GAPDH作為內(nèi)參，內(nèi)參目的基因GAPDH的設(shè)計和合成由寶生物有限公司合成。qRT-PCR引物序列如下，lncRNA ITGB1上游引物(F)：5′-CCTCTCAGCCTCCAGCGTTG-3′，下游引物(R)：5′-TGCTCTTGCTCACTCACACTCC-3′。GADPH：上游引物(F)：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物(R)：5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。

1.4 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書對提取的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用qRT-PCR的20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃、30 s后，進行40個循環(huán)反應(yīng)，95℃、5 s，60℃、34 s，運用溶解曲線檢測擴增物純度。

1.5 lncRNA ITGB1在乳腺癌的相對表達量，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算lncRNA ITGB1在乳腺癌組織中的相對表達量，所有實驗樣本重復(fù)3次，取3次的ct值的平均值為最終值?！鰿T值=樣本ct值-GAPDH ct值，將乳腺癌患者lncRNA ITGB1的表達水平的平均值作為cut-off值，分為高表達組和低表達組，進一步分析lncRNA ITGB1的表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA ITGB1在乳腺癌組織中的表達采用qRT-PCR法檢測lncRNA ITGB1在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達，如圖1所示，乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA ITGB1的表達水平(8.25±3.12)明顯高于癌旁組織(1.31±0.25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.551，P=0.000)。

圖1 lincITGB1 在90對乳腺癌組織及癌旁組織中的表達量

2.2 乳腺癌患者組織中l(wèi)ncRNA ITGB1表達與臨床病理特征的關(guān)系為分析lncRNA ITGB1的表達水平與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，以乳腺癌患者lncRNA ITGB1的平均表達水平為cut-off值，高于其為高表達組，低于其為低表達組。lncRNA ITGB1的表達與TNM分期(P=0.000)和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000)有關(guān)，但與年齡、腫瘤直徑大小、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及分化程度無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 lncRNA ITGB1與臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

3 討論

lncRNA本身不編碼蛋白質(zhì)，常以RNA的形式調(diào)控基因的表達，包括表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等。近期相關(guān)研究結(jié)果顯示，lncRNA是腫瘤診斷、預(yù)后及腫瘤風(fēng)險預(yù)測的重要的分子標(biāo)記物[9]。雖然在乳腺癌中已經(jīng)有H19、UCA1、GAS5和HOTAIR等lncRNAs被發(fā)現(xiàn)，如研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR通過在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesencly transition，EMT)過程中調(diào)控Snail蛋白的表達，對腫瘤細胞增殖、凋亡作用顯著。Cupta等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HOIAIR在乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移灶中表達明顯升高，并認為HOATR是預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要指標(biāo)，但是研究仍然有限。lncRNA ITGB1是一個新近研究發(fā)現(xiàn)的lncRNA，Wang等[11]首次發(fā)現(xiàn)其在膀胱癌中表達上調(diào)，并且研究證實ITGB1是由于其能調(diào)節(jié)EMT而促進膀胱癌的轉(zhuǎn)移。Yan等[8]發(fā)現(xiàn)，lncRNA ITGB1可以促進乳腺癌細胞的擴增、遷移和侵襲作用。并且也發(fā)現(xiàn)其能夠作為一個癌基因而影響EMT。

本研究從乳腺癌患者的臨床特征出發(fā)，分析lncRNA ITGB1與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。本研究通過qRT-PCR方法檢測了90例乳腺癌患者癌組織及正常癌旁組織中的表達，并分析該基因與相關(guān)臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA ITGB1在乳腺癌組織中高表達，明顯高于癌旁正常乳腺組織。另外，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA ITGB1的表達水平與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，提示其與腫瘤的進展有關(guān)。另外，本研究存在一定的局限性，僅分析lncRNA ITGB1與臨床病理特征的相關(guān)性，并沒有分析lncRNA ITGB1在乳腺癌中的功能，后續(xù)實驗可通過過表達ITGB1，分析其對乳腺癌細胞增殖和細胞周期的影響。

綜上所述，lncRNA ITGB1在乳腺癌組織中的表達升高，提示高表達可以作為腫瘤生物標(biāo)記物，為下一步尋找靶點基因提供了可靠依據(jù)。根據(jù)臨床病理特點，乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型和基地細胞型。乳腺癌的分子分型對其治療方案的選擇及臨床預(yù)后的評估具有重要意義。吳艾冉等[12]分析lncRNA MIAT在乳腺癌不同分子亞型中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其表達水平與乳腺癌分子分型等相關(guān)。本研究納入90例乳腺癌患者，未對其分子分型進行進一步的分析，后繼實驗可進一步分析lncRNA ITGB1與乳腺癌分子分型之間的關(guān)系，以期為乳腺癌的個體化治療及預(yù)后評估提供新的思路。另外，本研究選取的標(biāo)本為2017年-2018年的乳腺癌患者組織,無法統(tǒng)計其預(yù)后情況，今后統(tǒng)計隨訪數(shù)據(jù)，進一步探討lncRNA ITGB1與預(yù)后的關(guān)系。