甘森寧 陸梅穎 肖志邦

摘 ?要：該文介紹了植物內(nèi)生真菌分類鑒定的方法，主要包括形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定2種方法。

關(guān)鍵詞：植物;內(nèi)生真菌;鑒定

中圖分類號 ?S663.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）10-0036-02

真菌廣泛存在于自然界中，且種屬繁多，有些菌種形態(tài)上并無明顯差異，僅靠形態(tài)特征或生理、生化指標(biāo)，很難把握真菌之間的親緣關(guān)系[1]。雖然現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在真菌分類研究中應(yīng)用廣泛，真菌分類和系統(tǒng)發(fā)育研究也取得了很大的進(jìn)展[2]，但形態(tài)學(xué)鑒定仍是鑒定真菌的重要參考依據(jù)。對真菌進(jìn)行分類鑒定時(shí)，多采用形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)相結(jié)合的方法。

1 形態(tài)學(xué)鑒定

傳統(tǒng)的真菌分類主要參照魏景超《真菌鑒定手冊》[3]，依據(jù)真菌形態(tài)、理化特性及超微特征等表型特征，進(jìn)行初步分類工作。目前形態(tài)學(xué)的鑒定主要使用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡2種技術(shù)。

1.1 光學(xué)顯微鏡 根據(jù)內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征（生長速度、大小、菌落紋飾、質(zhì)地、邊緣）進(jìn)行分類及去重復(fù)，采用透明膠帶法粘貼好菌絲，鏡檢觀察真菌分生孢子梗、分生孢子形態(tài)及大小等顯微特征，參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行內(nèi)生真菌的初步分類。

1.2 掃描電鏡 近年來，越來越多的學(xué)者將掃描電鏡技術(shù)應(yīng)用于真菌的形態(tài)學(xué)鑒定中，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡雖然也能觀察到真菌的基本形態(tài)，但真菌的表面超微結(jié)構(gòu)必須使用掃描電鏡進(jìn)行觀察，在SEM下可清晰地分辨出真菌的菌絲、大分生孢子和小分生孢子[5]。采用插片法培養(yǎng)菌株讓其菌絲生長與玻璃片表面，取出玻璃片。首先用2.5%戊二醛在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.0）中固定樣品超過4h，然后洗滌3次。在PBS中用1%（W/V）鋨酸鋨（OsO4）后固定1h，再次洗滌3次。通過一系列乙醇（50，70，80，90，95和100%）將樣品在每個(gè)步驟脫水約15～20min，轉(zhuǎn)移到乙醇和乙酸異戊酯的混合物（v︰v=1︰1）約30min，然后轉(zhuǎn)移到純的乙酸異戊酯約1h。最終，在樣品表面涂覆上金鈀，之后用掃描電子顯微鏡觀察。

2 分子生物學(xué)鑒定

目前，在真菌分類方面的較常應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)主要有核酸序列分析、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析（RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析（AFLP）等。

2.1 核酸序列分析 核酸序列分析是目前常用的真菌分類技術(shù)之一。真核生物的rDNA單位包含18S、ITS、28S、IGS，其中5.8S兩側(cè)有2個(gè)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS（internal transcribed spacer）[6]。rDNA基因在真菌中廣泛存在，且多拷貝。由于ITS序列不加入成熟核糖體，選擇壓力比較小，進(jìn)化速度較快，表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性，在進(jìn)化中形成高度的保守性和一定的變異性，種間差異較為明顯[7]。然而，由于特定堿基位點(diǎn)的速率差異或類群之間進(jìn)化速率的差異等原因造成的基因沖突[8]，目前常用的單基因片段進(jìn)行的核酸序列分析并不能解決此問題。在此基礎(chǔ)上，Tayloretal[9]提出采用多基因片段構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹從而識別物種的方法（GCPSR），可能會成為真菌鑒定中較常采用的方法。何亞濤[10]等利用ITS和LSU基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，證明血紅紅曲M.sanguineus與紫色紅曲M.purpureus為不同種。

2.2 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析技術(shù)的原理是不同個(gè)體進(jìn)化過程中，DNA結(jié)構(gòu)存在差異。當(dāng)DNA序列在限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)發(fā)生差異，或當(dāng)DNA片段的插入、缺失或重排時(shí)，限制性內(nèi)切酶將基因組DNA酶解，產(chǎn)生很多長短不一的片段，這些片段以不同的遷移率經(jīng)過凝膠電泳，從而被區(qū)分出來，就可以獲得RFLP圖譜進(jìn)行多態(tài)性分析[11-12]。RFLP分析具有數(shù)據(jù)信息量大、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)。但RFLP技術(shù)存在對樣品純度要求高，無法檢測靶序列中的重復(fù)序列之類的缺點(diǎn)[13]。RFLP技術(shù)常用于真菌的研究，宋風(fēng)雅[14]等將PCR-RFLP分析技術(shù)應(yīng)用于橡膠林土壤真菌區(qū)系變化的研究，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間和土壤深度的變化，真菌18SrDNA的PCR-RFLP圖譜存在著一定的差異，PCR-RFLP技術(shù)能準(zhǔn)確反映土壤微生物的動(dòng)態(tài)變化。喬蓬蕾[15]以不同連作茬次黃瓜根際土壤為研究對象，利用末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）技術(shù)研究了土壤細(xì)菌、真菌菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，研究發(fā)現(xiàn)黃瓜連作障礙對真菌產(chǎn)生了一定的影響，建立了能解決連作障礙的方法。

2.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析 RAPD是由Welsh等[15]和Williams等[16]于1990年建立的一種建立在PCR基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記手段，RAPD在真菌上主要用于種群變異的研究及種間、種內(nèi)的區(qū)分等，在真菌的系統(tǒng)學(xué)研究也有應(yīng)用。RAPD分析技術(shù)所需模板量少，可以適應(yīng)種及種下各水平的進(jìn)化分析;因不使用同位素，較為安全;此外還具有速度快、成本低、靈敏度高等特點(diǎn)，但分析結(jié)果受很多相關(guān)因子的影響[17]，具有一定的使用局限性。龔斌[18]采用RAPD技術(shù)對3種紅樹林植物健康與非健康葉片中真菌進(jìn)行分類鑒定，對于分離到的157株內(nèi)生真菌，把它劃為19種不同的種，歸屬2個(gè)大的分支。韓利剛[19]選取瓶霉屬外瓶霉屬8個(gè)種的11個(gè)菌株，對其進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，根據(jù)分析結(jié)果，可將11個(gè)菌株劃分為8個(gè)群，分別代表了8個(gè)種，根據(jù)最長距離法還可將11個(gè)菌株分成兩大類，分別代表了瓶霉屬和外瓶霉屬，這與傳統(tǒng)的形態(tài)分類法的結(jié)果基本一致，證明RAPD技術(shù)是研究瓶霉屬、外瓶霉屬兩屬間及屬內(nèi)各菌種間的分類和相互關(guān)系的有效手段。

2.4 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析（AFLP） AFLP是基于RFLP與PCR技術(shù)的DNA指紋技術(shù)，同時(shí)具有RAPD技術(shù)和RFLP技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，適用于各種大小不同的基因組，是一種理想的分子標(biāo)記[19]?，F(xiàn)已廣泛用于分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)等領(lǐng)域，但在真菌上的應(yīng)用還較少。

但AFLP技術(shù)存在擴(kuò)增時(shí)容易出現(xiàn)假陽性、凝膠背景雜亂，難以鑒別等位基因等缺點(diǎn)，導(dǎo)致這項(xiàng)技術(shù)具有一定的局限性[20]。張艷菊[21]等利用16對引物對我國8個(gè)城市351個(gè)供試尖孢鐮孢菌進(jìn)行AFLP分析，結(jié)果表明，AFLP標(biāo)記選擇性擴(kuò)增多態(tài)性高，能夠揭示大量的多態(tài)性位點(diǎn)，可獲得親緣關(guān)系很近的菌株間DNA水平上的多態(tài)性及親緣關(guān)系，是研究黃瓜枯萎病菌基因組多態(tài)性的一種較為高效的分子標(biāo)記技術(shù)。卓英[22]采用AFLP技術(shù)分析了收集到的31個(gè)主要香菇栽培菌株的DNA多態(tài)性。采用6對引物共擴(kuò)增得到了443條DNA帶，其中共有條帶為189條，多態(tài)性比率為57.34%，可為香菇的栽培菌株質(zhì)量監(jiān)測和菌種鑒定提供快速有效的技術(shù)手段。

3 結(jié)語

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的高速發(fā)展，出現(xiàn)了許多更為快速有效的鑒定方法，為真菌分類提供了更多的有效幫助。在進(jìn)行真菌分類時(shí)，可以根據(jù)需要選擇較為符合實(shí)際情況的方法。

參考文獻(xiàn)

[1]楊祝良.基因組學(xué)時(shí)代的真菌分類學(xué)：機(jī)遇與挑戰(zhàn)[J].菌物學(xué)報(bào)，2013，32（6）：931-946.

[2]Yang Z L .Molecular techniques revolutionize knowledge of basidiomycete evolution[J].Fungal Diversity，2011，50（1）：47-58.

[3]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[4]徐佳，陳彬，雷曉凌，等.叢生盔形珊瑚共附生可培養(yǎng)真菌多樣性分析[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（8）：1193-1198.

[5]唐芳，歐陽毅，祁智慧.基于掃描電鏡觀察研究真菌孢子檢測對稻谷霉變判定[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2018，33（4）： 122-126.

[6]余知和，曾昭清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在真菌系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用及影響[J].菌物學(xué)報(bào)，2013，32（1）.

[7]李倩，閆淑珍，陳雙林.基于rDNA ITS序列對絨泡菌目黏菌系統(tǒng)發(fā)育的探討[J].菌物學(xué)報(bào)，2015，34（3）.

[8]鄒新慧，葛頌.基因樹沖突與系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究[J].植物分類學(xué)報(bào)，2008，46（6）：795-807.

[9]Taylor J W，Jacobson D J，Kroken S，et al.Phylogenetic Species Recognition and Species Concepts in Fungi[J].Fungal Genetics & Biology，2000，31（1）：0-32.

[10]何亞濤，冉琴琴，柳玉瑛，等.基于多基因分析對我國紅曲霉屬M(fèi)onascus真菌的系統(tǒng)發(fā)育研究[J].菌物學(xué)報(bào)，2018，37（09）：48-63.

[11]方炳良.限制性片段長度多態(tài)性分析[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1991（6）：376-380.

[12]劉寧，金保偉，胡景輝，等.真菌分類中分子生物學(xué)方法的原理及其應(yīng)用[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2017.

[13]余知和，曾昭清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在真菌系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用及影響[J].菌物學(xué)報(bào)，2013，32（1）.

[14]徐傳林，李會軍，李萍，等.川貝母藥材分子鑒定方法研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010（3）：226-230.

[15]Welsh J，Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic Acids Research，1990，18（24）：7213-7218.

[16]Williams J G K，Kubelik A R，Livak K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Research，1990，18（22）：6531-6535.

[17]龔斌，方懷義，劉小雪，等.三種紅樹林植物健康與非健康葉片中真菌的比較[J].廣西植物，2017（3）.

[18]李敏慧，向梅梅.RAPD在真菌分類鑒定上的應(yīng)用[J].仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，16（1）：61-67.

[19]裴德翠.AFLP：DNA指紋分析的有力手段[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2002，30（3）：66-70.

[20]張傳博，蘇曉慶.幾種基于基因組DNA的真菌分類技術(shù)研究進(jìn)展[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，24（1）.

[21]張艷菊，陳霞，劉東，等.黃瓜枯萎病菌遺傳多樣性的AFLP分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2011，41（3）：301-304.

[22]卓英，譚琦，陳明杰，等.香菇主要栽培菌株遺傳多樣性的AFLP分析[J].菌物學(xué)報(bào)，2006，25（2）.

（責(zé)編：張宏民）