楊陶波， 易 寒， 宋 娟， 陳 菲， 朱 瑩， 王壽勇

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院麻醉科，兒童發(fā)育疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地，重慶 400014)

丙泊酚(propofol,P)是目前臨床上最常使用的全身麻醉藥物之一。研究表明，丙泊酚能夠抑制包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1-3]，但其機(jī)制目前尚不完全清楚。與此同時(shí)，趨化因子及其受體與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系已經(jīng)得到證實(shí)，CXC趨化因子受體(CXC-chemokine receptor，CXCR)4/CXCR7介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被認(rèn)為在腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著重要作用[4-6]。丙泊酚是否能夠通過CXCR4/CXCR7信號(hào)途徑而影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，值得關(guān)注。本研究擬以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察臨床濃度的丙泊酚對(duì)其CXCR4/CXCR7表達(dá)和體外遷移能力的影響。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和主要試劑

MCF-7細(xì)胞株由本院中心實(shí)驗(yàn)室保存。丙泊酚(AstraZeneca)；脂肪乳(lipid emulsion,E；購(gòu)自四川科倫)；胎牛血清(杭州四季青)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；兔抗人CXCR7多克隆抗體(GeneTex)；兔抗人CXCR4多克隆抗體(北京博奧森)；鼠源GAPDH的 I 抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG抗體(北京中杉金橋)；重組人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell derived factor 1α,SDF-1α;購(gòu)自Peprotech)；Transwell小室(Corning)；TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(北京天根)；結(jié)晶紫染液購(gòu)于碧云天生物研究所；MTT試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；PCR引物由上海生工合成。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 在37 ℃、5% CO2條件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞，2 d換液 1 次。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在6 cm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分成4組：對(duì)照組(control,C組)、脂肪乳組(E組)、丙泊酚3 mg/L組(P1組)和丙泊酚8 mg/L組(P2組)。

2.2 細(xì)胞處理 待細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，然后P1組和P2組分別更換含有終濃度為3 mg/L和8 mg/L丙泊酚的培養(yǎng)基，E組更換含有脂肪乳的培養(yǎng)基，C組更換新鮮普通培養(yǎng)基。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的橫向遷移能力 將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右時(shí)，換無血清培養(yǎng)基，饑餓細(xì)胞12 h，用200 μL槍頭在每孔相同的位置做線性劃痕，用PBS輕輕沖洗3次，每孔加入含有濃度為100 μg/L SDF-1α的DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，在倒置顯微鏡下拍照，并沿劃痕邊緣等間距取3處測(cè)量劃痕寬度，取平均值，記為0 h劃痕寬度。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出6孔板，在相同觀察點(diǎn)測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率：劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.4 Tanswell小室檢測(cè)細(xì)胞的縱向遷移能力 各組細(xì)胞采用預(yù)熱至37℃的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，重懸于無血清培養(yǎng)基中，采用Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整其濃度為5×108/L。Transwell上室每孔加入細(xì)胞懸液200 μL，下室加入含100 μg/L SDF-1α的完全培養(yǎng)基800 μL，以不含SDF-1α的完全培養(yǎng)基為空白對(duì)照。在37 ℃、5% CO2平衡的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后取出，無水甲醇固定20 min，結(jié)晶紫染色30 min，棉簽?zāi)ㄈド蠈游催w移的細(xì)胞，隨機(jī)取6個(gè)視野(×400)在倒置顯微鏡下拍照，計(jì)算MCF-7細(xì)胞趨化指數(shù)(chemotactic index,CI)：CI=各觀察孔趨化至下室的細(xì)胞總數(shù)/空白對(duì)照孔趨化至下室的細(xì)胞總數(shù)。

2.5 RT-qPCR測(cè)定CXCR4和CXCR7的mRNA水平 根據(jù)NCBI Genebank中的CXCR4、CXCR7和β-actin序列設(shè)計(jì)引物，見表1。細(xì)胞加藥處理24 h后采用TRIzol法提取細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)純化后逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定CXCR4和CXCR7的mRNA水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，并同時(shí)測(cè)定β-actin水平為內(nèi)參照，目的基因表達(dá)水平使用2-ΔΔCt法分析。反轉(zhuǎn)錄條件設(shè)定為37℃ 15 min、85 ℃ 5 s。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 RT-qPCR引物序列

2.6 Western blot 檢測(cè)CXCR4和CXCR7蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞加藥處理24 h后參照蛋白提取細(xì)胞試劑盒說明書提取總蛋白，BCA法測(cè)定全蛋白濃度，加緩沖液煮沸5 min變性。以30 μg蛋白上樣行SDS-PAGE，將分離膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用10%脫脂奶粉封閉1 h，加入特異性抗CXCR4和CXCR7抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。以GAPDH為內(nèi)參照，ECL曝光顯影，結(jié)果采用Bio-Rad quantity One軟件進(jìn)行分析。

2.7 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，每孔4 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置脂肪乳和空白對(duì)照。P1和P2組細(xì)胞培給予相應(yīng)濃度丙泊酚處理，對(duì)照組分別給予等體積脂肪乳或培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,小心吸去上清，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜溶液110 μL，待結(jié)晶物溶解后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graph Pad Prism 7.0繪圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞橫向遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C組、E組、P1組和P2組4組細(xì)胞24 h劃痕愈合率分別為39.42%±2.21%、37.72%±1.64%、20.01%±1.48%和18.36%±1.80%, E組劃痕愈合率與C組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，P1和P2組愈合率較C組下降(P<0.05)；與E組相比， P1和P2組愈合率下降(P<0.05)；P1組與P2組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

Figure 1. The effects of propofol on the migration ability of MCF-7 cells detected by wound-healing assay (×100). Mean±SD.n=3.#P<0.05vsC group;*P<0.05vsE group.

圖1 丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞劃痕愈合率的影響

2 丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞縱向遷移力的影響

SDF-1α趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C組、E組、P1組和P2組4組趨化指數(shù)分別為1.68±0.13、1.49±0.08、1.09±0.06和1.00±0.05。E組趨化指數(shù)較C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P1和P2組趨化指數(shù)較C組降低(P<0.05)；與E組相比，P1與P2組趨化指數(shù)下降(P<0.05)；P1與P2組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

3 丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞CXCR4/CXCR7 mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，各組CXCR4/CXCR7的mRNA表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

4 丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞CXCR4/CXCR7 蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，E組CXCR4/CXCR7 的蛋白表達(dá)水平較C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，P1和P2組表達(dá)水平較C組降低(P<0.05)；與E組相比，P1、P2組CXCR4/CXCR7的蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；P2組CXCR4/CXCR7 蛋白表達(dá)水平較P1組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 2. The effects of propofol on the migration ability of MCF-7 cells detected by Transwell assay (×400).Mean±SD.n=3.#P<0.05vsC group;*P<0.05vsE group.

圖2 丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞趨化能力的影響

Figure 3. The effects of propofol on the mRNA expression of CXCR4/CXCR7 in the MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.

圖3 丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞CXCR4/CXCR7 mRNA表達(dá)的影響

Figure 4. The effects of propofol on the protein expression of CXCR4/CXCR7 in the MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsC group;*P<0.05vsE group.

圖4 丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞CXCR4/CXCR7蛋白表達(dá)水平的影響

5 丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組相比，P1和P2組MCF-7細(xì)胞活力無顯著改變，見圖5 。

Figure 5. The effects of propofol on the viability of MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.

圖5 丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株CXCR4/CXCR7 mRNA表達(dá)水平和細(xì)胞活力無顯著影響，但可顯著降低其CXCR4/CXCR7蛋白的表達(dá)水平，抑制體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞遷移能力。

腫瘤細(xì)胞的遷移能力反映其侵襲能力，臨床上表現(xiàn)為手術(shù)后腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，后者是目前惡性腫瘤外科治療上面臨的最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。有研究表明，接受丙泊酚麻醉的患者，其術(shù)后腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有所降低，無復(fù)發(fā)生存時(shí)間延長(zhǎng)[1-3]，但相關(guān)研究結(jié)論仍然存在爭(zhēng)議[7-8]，這表明對(duì)丙泊酚影響腫瘤遷移能力的現(xiàn)象，還需從多種可能的機(jī)制進(jìn)行廣泛探討。CXCR4和CXCR7同為C-X-C趨化因子受體亞家族，屬于典型的具有7次跨膜區(qū)段的G蛋白偶聯(lián)受體，與SDF-1構(gòu)成經(jīng)典的生物信號(hào)軸，在胚胎發(fā)育、病毒感染、干細(xì)胞歸巢以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等廣泛生物學(xué)過程中起著重要作用[9-11]。有研究表明，SDF-1/CXCR4信號(hào)通路激活，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及調(diào)控血管細(xì)胞間黏附分子-1和整合素β1等表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丙泊酚處理后，MCF-7乳腺癌細(xì)胞株的CXCR4和CXCR7蛋白表達(dá)水平受到抑制，細(xì)胞對(duì)SDF-1的趨化能力明顯下降；這表明丙泊酚可能通過影響SDF-1/CXCR4(CXCR7)信號(hào)通路抑制MCF-7細(xì)胞的遷移能力，提示對(duì)于臨床上采用手術(shù)治療的乳腺癌患者，有可能通過采用丙泊酚全身麻醉而優(yōu)化治療效應(yīng)，降低手術(shù)后惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；也提示CXCR4和CXCR7受體拮抗劑可能在抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有臨床價(jià)值。與此同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)3和8 mg/L丙泊酚對(duì)體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞活性沒有明顯影響，提示其對(duì)細(xì)胞遷移能力的抑制，并非通過降低細(xì)胞活性所致[15]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚在抑制CXCR4和CXCR7蛋白表達(dá)水平的同時(shí)，其mRNA表達(dá)并未發(fā)生明顯改變，其機(jī)制值得思考。有研究顯示，丙泊酚可以在不改變基因表達(dá)水平的情況下，通過抑制泛素復(fù)合酶體的降解而提高小鼠心肌小窩蛋白3的表達(dá)水平，從而產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng)[16]；也可通過激活泛素復(fù)合酶體的活性而加速PTEN蛋白的降解，活化AKT信號(hào)途徑而緩解缺血性腦損傷[17]。在本研究中，丙泊酚在未改變CXCR4/CXCR7 mRNA水平的情況下，引起了其蛋白表達(dá)水平的變化，從而導(dǎo)致體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞遷移能力下降，是否是由于丙泊酚通過前述類似機(jī)制引起CXCR4/CXCR7蛋白降解加快，或在基因轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用所致，值得進(jìn)一步研究。

作為目前臨床上最常用的全身麻醉藥，丙泊酚的臨床麻醉濃度為3～8 mg/L[18]，本研究以人源MCF-7乳腺癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，證實(shí)上述臨床麻醉濃度的丙泊酚能明顯抑制MCF-7細(xì)胞遷移能力。同時(shí)，前述2種濃度的丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞體外遷移能力的抑制程度相似，提示在臨床濃度范圍內(nèi)，丙泊酚對(duì)MCF-7細(xì)胞的影響程度沒有顯著差異。但更高或更低濃度的丙泊酚，以及其不同作用時(shí)間的抑制效應(yīng)如何，值得進(jìn)一步研究。

此外，包括乳腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)涉及復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)途徑，本研究結(jié)果僅提示CXCR4/CXCR7信號(hào)途徑參與其中，其重要性到底如何，以及它與其它信號(hào)途徑之間如何協(xié)同和相互影響，尚需要進(jìn)一步探索。并且惡性腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移所面臨的生物學(xué)環(huán)境與離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)存在巨大差異，本研究結(jié)果能否在活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床上獲得證實(shí)，尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，臨床麻醉濃度的丙泊酚對(duì)體外培養(yǎng)的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的遷移能力具有抑制作用，其機(jī)制與抑制CXCR4/CXCR7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)，與抑制細(xì)胞活性無關(guān)。