劉曉虹， 張鳳云， 王 坤， 王志榮， 張卓琦△

(1 徐州醫(yī)科大學(xué), 2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇 徐州 221000)

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是導(dǎo)致全世界人類死亡的主要原因之一，而心肌梗死后的心力衰竭更加重了健康負(fù)擔(dān)[1]。臨床心肌梗死患者往往同時患有糖尿病[2]，合并高糖血癥增加了心肌梗死患者死亡率和住院期間的并發(fā)癥[3]。目前治療IHD的方法僅能延緩，而不能阻止或者逆轉(zhuǎn)其所帶來的心力衰竭的發(fā)生[4]。近年來干細(xì)胞療法作為心肌梗死新興的治療方法備受關(guān)注，其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)以其易于獲取和增殖等特點成為首選種子細(xì)胞。BMSCs移植可以通過促進多種細(xì)胞因子分泌，包括血管內(nèi)皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子和胰島素樣生長因子等，促進心肌梗死患者心功能的恢復(fù)[5]，但糖尿病患者自體干細(xì)胞卻無法完成這一修復(fù)作用[6]，提示長期高糖暴露嚴(yán)重?fù)p害了BMSCs的功能。深入研究表明高糖條件下的BMSCs表現(xiàn)為早衰、基因組不穩(wěn)定和端粒改變[7-9]，但是高糖條件下BMSCs衰老的發(fā)生和調(diào)控機制尚不明確。此外，異體移植干細(xì)胞的免疫原性和倫理問題是目前干細(xì)胞移植領(lǐng)域尚未攻克的難題，糖尿病患者限于以上種種原因往往需要移植自身的干細(xì)胞。因此，如何有效提高這類患者干細(xì)胞的功能及移植效率，這是近年來心肌梗死合并糖尿病患者干細(xì)胞療法的研究重點。

作為靶向P53的微小RNA(microRNA，miRNA，miR)，miR-34a可通過多種信號途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、衰老等[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在心肌梗死[11]和糖尿病[12]患者血清中均顯著升高，因此可能參與心肌梗死合并糖尿病的發(fā)生及發(fā)展。本課題探究外源性miR-34a是否可加重高糖條件下BMSCs衰老的發(fā)生，并探究miR-34a促衰老的機制及其相關(guān)信號通路，為進一步臨床應(yīng)用糖尿病患者自體BMSCs治療糖尿病心肌梗死提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

雄性SD大鼠(3周齡)，60～80 g，購于徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證編號為2201172797。

2 主要試劑

胎牛血清購自依科賽生物科技有限公司；DMEM/高糖(high glucose,HG)和DMEM/正常濃度糖(normal glucose,NG)培養(yǎng)基均購自HyClone；胰酶細(xì)胞消化液和細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒均購于碧云天生物有限公司；rno-miR-34a-5p 和沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)引物均由北京天根生化科技有限公司設(shè)計及合成；rno-miR-34a-5p 過表達/沉默序列和siRNA-SIRT1序列(表 1)均由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；X-treme siRNA Transfection Reagent購自Roche；抗SIRT1和叉頭框蛋白O3a(forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a)抗體均購自Cell signaling；抗P21抗體購自Abcam；抗GAPDH兔多克隆抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購自Dojindo。

3 主要方法

3.1 大鼠BMSCs的分離及培養(yǎng) 提取健康雄性SD大鼠(60～80 g) 股骨及脛骨骨髓，參考文獻方法[13]采用全骨髓培養(yǎng)法獲得BMSCs，該實驗所用細(xì)胞均為3～5代培養(yǎng)于DMEM/NG培養(yǎng)基中的細(xì)胞，生長狀態(tài)良好。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)方法對其表面特殊標(biāo)記抗體進行鑒定，BMSCs高表達CD90，CD29和CD44，幾乎不表達CD34和CD45。

3.2 高糖培養(yǎng)細(xì)胞模型的建立 取3～5代培養(yǎng)的BMSCs，參考文獻[14]方法將細(xì)胞分為2組：一組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于DMEM/NG(含糖5.5 mmol/L)培養(yǎng)基中作為正常糖對照組(NG組)，另一組細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/HG (含糖25 mmol/L)培養(yǎng)基中作為HG組(用于模擬糖尿病患者體內(nèi)高糖微環(huán)境)，當(dāng)BMSCs生長達70%～80%融合時及時傳代，連續(xù)培養(yǎng)4 周進行后續(xù)實驗。

3.3 CCK-8法檢測BMSCs的活力 將NG組與HG組的BMSCs按每孔3 000個細(xì)胞接種于96孔板，CCK-8法檢測不同濃度葡萄糖對細(xì)胞活力的影響。為進一步探索miR-34a在高糖條件下對BMSCs活力的影響，取HG組BMSCs分別轉(zhuǎn)染miR-34a mimic、miR-34a inhibitor和miR-34a NC，48 h后用CCK-8法檢測細(xì)胞活力的變化。具體操作參照CCK-8試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀測定樣本450 nm波長處吸光度(A)值。

3.4 過表達或沉默miR-34a或SIRT1基因的表達 將BMSCs按每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板，過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染操作按X-treme siRNA Transfection Reagent說明書，參考文獻[13]方法將20 nmol/L miR-34a mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染至BMSCs中過表達或沉默miR-34a，將100 nmol/L siRNA-SIRT1轉(zhuǎn)染至BMSCs中敲減SIRT1的表達，各因子轉(zhuǎn)染時間均為48 h。

3.5 RT-qPCR法檢測BMSCs的miR-34a及SIRT1 mRNA的表達水平 各組細(xì)胞處理結(jié)束后，TRIzol試劑一步從BMSCs中提取總RNA，采用兩步法進行RT-qPCR反應(yīng)。miR-34a、SIRT1、U6和β-actin上下游引物均由北京天根生化科技有限公司設(shè)計及合成，具體序列見表1(其中rno-miR-34a-5P反向引物由天根試劑盒內(nèi)自帶)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

表1 RT-qPCR的引物序列和miR-34a mimic/inhibitor的寡核苷酸序列

3.6 Western blot分析 各組細(xì)胞處理結(jié)束后，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白；經(jīng)BCA法測定濃度后行聚丙烯酰胺凝膠電泳；按照濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；5%脫脂奶粉溶液37 ℃ 孵育2 h；I 抗4 ℃孵育過夜；TBST洗膜后 II 抗37 ℃孵育1 h；再次洗膜，增強化學(xué)發(fā)光法顯色。用Image J圖像分析軟件進行半定量分析，GAPDH作為內(nèi)參照。

3.7 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色法檢測衰老細(xì)胞 各組細(xì)胞處理結(jié)束后，經(jīng)PBS 沖洗，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min，PBS再次沖洗后，加入染色工作液，37 ℃無CO2條件下孵育過夜；普通光學(xué)顯微鏡下觀察，每個樣本計數(shù)600個細(xì)胞，胞漿藍染者為衰老細(xì)胞，計數(shù)陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組比較采用Student-t檢驗方法，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 在高糖條件下BMSCs中miR-34a生成增加

將BMSCs置于NG或HG培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)4周，RT-qPCR檢測miR-34a的表達情況。結(jié)果顯示與NG組相比，HG組的miR-34a表達明顯上調(diào)(P<0.01)，見圖1A。為了進一步研究miR-34a對BMSCs功能的影響，我們應(yīng)用轉(zhuǎn)染的方式增加miR-34a或抑制miR-34a的表達，RT-qPCR技術(shù)驗證轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明與HG組相比，HG+miR-34a mimic組的miR-34a表達明顯上調(diào)(P<0.01)，HG+miR-34a inhibitor組的miR-34a表達明顯下調(diào)(P<0.01)，且HG組與HG+miR-34a NC組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1B。

Figure 1. The relative expression of miR-34a in each group of the BMSCs was detected by RT-qPCR. U6 was used as an internal control. A: the effect of high glucose on the expression of miR-34a in the BMSCs; B: detection of transfection efficiency. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group.

圖1 RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中miR-34a的相對表達量

2 miR-34a與高糖條件下BMSCs的活力有關(guān)

本實驗用CCK-8法檢測高糖對BMSCs活力的影響，結(jié)果顯示第3 天開始，HG組較NG組的細(xì)胞活力減弱(P<0.05)，見圖2A；為進一步探索miR-34a與高糖條件下BMSCs活力的關(guān)系，用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染了miR-34a mimic和miR-34a inhibitor 48 h之后的BMSCs的活力，結(jié)果顯示第3天開始，HG+miR-34a mimic組較HG+miR-34a NC組細(xì)胞活力明顯減弱(P<0.01)，見圖2B；而HG+miR-34a inhibitor組較HG+miR-34a NC組表現(xiàn)出較好的細(xì)胞活力(P<0.01)，見圖2C。

Figure 2. The effect of miR-34a on the viability of BMSCs under high glucose condition was detected by CCK-8 assay. A: the effect of high glucose on the viability of BMSCs; B: the effect of miR-34a mimic on the viability of BMSCs under high glucose condition; C: the effect of miR-34a inhibitor on the viability of BMSCs under high glucose condition. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG+miR-34a NC group.

圖2 CCK-8法檢測miR-34a對高糖條件下BMSCs活力的影響

3 miR-34a與高糖條件下BMSCs衰老有關(guān)

與NG組相比，HG組β-半乳糖苷酶陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)；為進一步探索miR-34a與高糖條件下BMSCs衰老的關(guān)系，我們檢測轉(zhuǎn)染了miR-34a mimic和miR-34a inhibitor 之后的BMSCs的衰老水平，結(jié)果表明與HG組相比，HG+miR-34a mimic組的β-半乳糖苷酶陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)，HG+miR-34a inhibitor組的β-半乳糖苷酶陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，且HG組與HG+miR-34a NC組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。與上述染色結(jié)果一致，Western blot結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組的P21表達水平明顯升高(P<0.01)；與HG組相比，HG+miR-34a mimic組的P21表達水平明顯升高(P<0.01)，HG+miR-34a inhibitor組的P21表達水平明顯降低(P<0.01)，見圖4。

Figure 3. The effect of miR-34a on the senescence of BMSCs under high glucose condition was detected by senescence-associated β-galactosidase assay (×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group.

圖3 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色法檢測miR-34a對高糖條件下BMSCs衰老水平的影響

4 miR-34a可調(diào)控高糖條件下BMSCs中SIRT1和FOXO3a的表達

綜合了miRBase、 TargetScan、 PicTar和miRanda四大軟件庫，采用生物信息學(xué)方法分析，結(jié)果表明SIRT1是miR-34a的潛在靶點。為了驗證miR-34a是否影響高糖條件下BMSCs中SIRT1的表達，分別用RT-qPCR和Western blot法從mRNA和蛋白水平進行驗證。結(jié)果顯示在mRNA水平，各組細(xì)胞中SIRT1的mRNA表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，SIRT1不受miR-34a表達情況的影響，見圖5；但在蛋白水平，與NG組相比，HG組的SIRT1表達水平明顯降低(P<0.01)；與HG組相比，HG+miR-34a mimic組的SIRT1表達水平明顯降低(P<0.01)， HG+miR-34a inhibitor組的SIRT1表達水平明顯升高(P<0.01)，見圖6。上述結(jié)果表明，SIRT1受miR-34a轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)節(jié)。此外，我們進一步用Western blot技術(shù)檢測了FOXO3a蛋白的表達情況，結(jié)果顯示與NG組相比，HG組的FOXO3a蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)；與HG組相比，HG+miR-34a mimic組的FOXO3a蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，HG+miR-34a inhibitor組的FOXO3a蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，見圖7。

Figure 4. The effect of miR-34a on the protein expression of P21 in the BMSCs under high glucose condition was determined by Western blot. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group.

圖4 Western blot檢測miR-34a對高糖條件下BMSCs中P21蛋白表達水平的影響

Figure 5. The effect of miR-34a on the mRNA expression of SIRT1 in the BMSCs under high glucose condition was detected by RT-qPCR. β-actin was used as an internal control. Mean±SD.n=3.

圖5 RT-qPCR法檢測miR-34a對高糖條件下BMSCs中SIRT1 mRNA表達水平的影響

5 高糖條件下BMSCs中miR-34a 誘導(dǎo)細(xì)胞衰老與SIRT1緊密相關(guān)

確定SIRT1為miR-34a靶蛋白之后，為了證實miR-34a是否通過調(diào)節(jié)SIRT1的表達來調(diào)控高糖條件下BMSCs衰老的發(fā)生，我們向HG組BMSCs中轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor或siRNA-SIRT1或者兩者共同轉(zhuǎn)染，Western blot法驗證siRNA-SIRT1轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示與HG組相比，HG+siRNA-SIRT1組的SIRT1表達水平明顯降低(P<0.01)；與HG+miR-34a inhibitor組相比，HG+miR-34a inhibitor+siRNA-SIRT1組SIRT1表達降低(P<0.01)，見圖8。進一步研究發(fā)現(xiàn)，類似于miR-34a mimic轉(zhuǎn)染組，與HG組相比，HG+siRNA-SIRT1組的P21表達水平明顯升高(P<0.01)，即在高糖條件下BMSCs衰老的調(diào)節(jié)過程中，敲減SIRT1表達與過表達miR-34a發(fā)揮著相似的作用，并且當(dāng)向HG+miR-34a inhibitor組加入siRNA-SIRT1后，miR-34a inhibitor對BMSCs中P21表達的抑制作用被部分減弱(P<0.05)，見圖9。

6 miR-34a通過SIRT1/FOXO3a信號通路誘導(dǎo)高糖條件下BMSCs衰老的發(fā)生

與HG組相比，HG+siRNA-SIRT1組的FOXO3a表達水平明顯升高(P<0.01)，HG+miR-34a inhibitor組的FOXO3a表達水平明顯降低(P<0.01)，而當(dāng)向HG+miR-34a inhibitor組加入siRNA-SIRT1后，miR-34a inhibitor對FOXO3a的抑制作用被部分減弱(P<0.05)，見圖10。

Figure 6. The effect of miR-34a on the protein expression of SIRT1 in the BMSCs under high glucose condition was determined by Western blot. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group.

圖6 Western blot檢測miR-34a對高糖條件下BMSCs中SIRT1蛋白表達水平的影響

Figure 7. The effect of miR-34a on the protein expression of FOXO3a in the BMSCs under high glucose condition was determined by Western blot. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group.

圖7 Western blot檢測miR-34a對高糖條件下BMSCs中FOXO3a蛋白表達水平的影響

Figure 8. The protein expression of SIRT1 in each group of the BMSCs was determined by Western blot. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vsHG+siRNA-SIRT1 group;▲▲P<0.01vsHG+miR-34a inhibitor group.

圖8 Western blot檢測各組細(xì)胞中SIRT1蛋白的表達水平

Figure 9. miR-34a increased the expression of P21 protein in the BMSCs under high glucose condition by decreasing SIRT1 expression. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vsHG+siRNA-SIRT1 group;▲P<0.05vsHG+miR-34a inhibitor group.

圖9 miR-34a通過SIRT1調(diào)控高糖條件下BMSCs中P21蛋白的表達

Figure 10. miR-34a increased the protein expression of FOXO3a in the BMSCs under high glucose condition by decreasing SIRT1 expression. GAPDH was used as an internal control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNG group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vsHG+siRNA-SIRT1 group;▲P<0.05vsHG+miR-34a inhibitor group.

圖10 miR-34a通過SIRT1調(diào)控高糖條件下BMSCs中FOXO3a蛋白的表達

討 論

隨著細(xì)胞治療研究的深入，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法是目前干預(yù)心肌梗死的有效手段，但長期高糖暴露嚴(yán)重?fù)p害了BMSCs的功能。深入研究表明高糖條件下的BMSCs表現(xiàn)為衰老增加和增殖能力下降[14]。顯然，衰老的BMSCs是不適合作為種子細(xì)胞來進行移植的。那么如何降低高糖條件下BMSCs衰老的發(fā)生，進而提高其功能和移植效率是我們目前急需解決的問題。

miRNAs是一類高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，長約21～25 nt，廣泛存在于真核生物中，并在基因轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要的調(diào)控功能[15]。隨著人們對糖尿病和心血管病發(fā)生機制研究的深入，近年來研究表明多種miRNAs參與糖尿病和心血管病發(fā)生發(fā)展的調(diào)控[16]。在已知的miRNAs中，miR-34a作為P53的靶向小分子RNA，其與衰老的關(guān)系在眾多研究中到得一定闡釋[10]。miR-34a隸屬于miR-34家族，普遍存在于肺組織之外的各種組織中[17]。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-34a在心肌梗死[11]和糖尿病[12]患者血清中均顯著升高。

本實驗中我們首先證實了miR-34a確實表達于BMSCs中，其次我們發(fā)現(xiàn)在高糖條件下BMSCs中miR-34a的表達明顯上調(diào)，過表達miR-34a可以加重高糖條件下BMSCs的衰老水平，同時降低BMSCs的活力，而抑制miR-34a的表達則表現(xiàn)出相反的效應(yīng)。

SIRT1是miR-34a的潛在靶點之一，在以往多項研究中被認(rèn)為是一種長壽基因[18]，它是一種依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶[19]，主要通過使下游靶蛋白去乙?；诩?xì)胞周期[20]和衰老[21]等的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往研究表明在氧化應(yīng)激條件下，SIRT1可以通過促進FOXO3a去乙?；M而抑制其轉(zhuǎn)錄活性[22]。FOXO3a是叉頭基因轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，與多種細(xì)胞功能有明顯聯(lián)系，包括氧化應(yīng)激[22]和衰老等[23]。此外，研究表明FOXO3a與糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)[24]。

本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在高糖條件下BMSCs中SIRT1蛋白表達明顯降低，F(xiàn)OXO3a蛋白表達明顯升高，過表達miR-34a進一步加重SIRT1表達的降低和FOXO3a表達的升高，而抑制miR-34a的表達則表現(xiàn)恰恰相反。但在mRNA水平，SIRT1不受miR-34a表達情況的影響。以上研究表明SIRT1受miR-34a轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)節(jié)。進一步研究發(fā)現(xiàn)在高糖條件下，敲減BMSCs中SIRT1表達與過表達miR-34a對P21及FOXO3a蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)揮著相似的作用，并且當(dāng)向HG+miR-34a inhibitor組加入siRNA-SIRT1后，miR-34a inhibitor對高糖條件下BMSCs中的P21及FOXO3a表達的抑制作用被部分減弱。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明miR-34a通過SIRT1/FOXO3a信號通路誘導(dǎo)高糖條件下BMSCs衰老。因此，抑制miR-34a的表達為臨床優(yōu)化糖尿病患者自體干細(xì)胞治療糖尿病心肌梗死提供了實驗依據(jù)和新的理論支持。