王丹丹，高 榮，閆 濱

1山東中醫(yī)藥大學藥學院；2山東宏濟堂制藥集團有限公司；3山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，濟南 250355

三葉青(Tetrastigmatishemsleyani)為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤 (TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，其塊根名為蛇附子，別名有石猴子、石抱子、攔山虎等，藥用部位為塊根、果實或全草。據(jù)《中國植物志》記載，三葉崖爬藤全株供藥用，具有活血散瘀、解毒、化痰的作用[1]。其性味微苦，歸經(jīng)平，無毒，具有清熱解毒、活血散結(jié)、消炎止痛、祛風化痰、理氣健脾等功效。三葉青產(chǎn)于浙江、江蘇、江西等地，產(chǎn)地常用作民間用藥，用來治療感冒。我們經(jīng)過文獻和實驗篩選，認為三葉青抗RSV病毒作用值得深入研究。

目前有關(guān)三葉青提取物的抗病毒作用研究，國內(nèi)外對其的關(guān)注度不夠，且研究深度不足，也未能從三葉青中提取分離出具有較為顯著抗病毒活性的單體化合物。楊學樓等[2]發(fā)現(xiàn)三葉青提取物具有抗仙臺病毒和流感病毒的作用，為三葉青應(yīng)用于病毒所致疾病的防治提供了一定的依據(jù)；楊雄志等[3]研究了三葉青的乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、正丁醇4個部分提取物的抗乙肝病毒活性，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取部位有顯著的抑制HBV DNA拷貝的作用，提示三葉青提取物在體外有顯著的抗HBV活性；楊大堅等[4]也發(fā)現(xiàn)三葉青脂溶性成分具有抗病毒作用。董宜旋等[5]發(fā)現(xiàn)三葉青提取物體外對 HIV-1 活性有一定的抑制作用，并進一步探討其機制。

呼吸道合胞病毒(RSV)被認為是世界范圍內(nèi)嬰幼兒病毒性支氣管炎和肺炎疾病的主要病毒病原，是副粘液病毒科的RNA病毒[6]，易由空氣、飛沫或者直接接觸病菌從而進入易感人群的呼吸道，在侵入機體后首先在鼻咽部粘膜上進行增殖，從而引起上呼吸道感染。而對于一些免疫力較為低下的嬰幼兒及老年人，在RSV引起上呼吸道感染后，病毒可繼續(xù)由鼻咽部向下到達各支氣管甚至是肺，進而演變成嚴重的支氣管炎、肺炎，嚴重時甚至會出現(xiàn)全身毒血癥狀[7]。鑒于RSV引起的疾病并沒有針對性強的治療藥物，我們重點研究三葉青對RSV病毒的直接抑制作用。現(xiàn)將三葉青提取物體外抗呼吸道合胞病毒(RSV)實驗結(jié)果報道如下。

1 材料與儀器

1.1 藥物

1.1.1 藥物提取

將干燥的三葉青塊根搗至粗粉末，并用高速藥物粉碎機粉碎為100目細粉末，將全部粉末分批用15倍量的60 wt%乙醇加熱超聲提取20 min，加熱回流提取20 min，將提取液過濾并減壓濃縮，濾渣用同樣方法提取2次，將濃縮后的提取液用水混懸，得到混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(萃取溶劑與三葉青提取液混懸液的體積比在1.5：1)，萃取中產(chǎn)生的乳化層用加熱超聲的方法破乳，至提取液幾乎無色后停止萃取，將萃取液各部分分別減壓濃縮干燥至恒重。實驗所制備的三葉青60 wt%乙醇提取物，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物、水部分，及乙酸乙酯萃取部位硅膠柱、水部分大孔樹脂柱分離得到的各段樣品。以上藥物以DMSO溶解后，以細胞維持液配成試驗所需濃度。

1.1.2 陽性對照藥物

山東魯抗辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的利巴韋林注射液(批號為1612246411)，濃度為50 mg/mL。利巴韋林是廣譜抗病毒藥物，用作本實驗的陽性對照藥物。用PBS將其稀釋到200 μg/mL的濃度，用0.22 μm的濾器過濾除菌，放置于-20 ℃冰箱備用。

1.2 細胞

MA104(恒河猴胚胎腎細胞)為RSV 敏感細胞，由山東省醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所微生物室提供，本科室保存。

1.3 病毒

RSV(呼吸道合胞病毒，Long株，2000年10月引自中國預防醫(yī)學科學院病毒所毒種室)

1.4 試劑及儀器

細胞培養(yǎng)液：1640細胞培養(yǎng)液，GIBCO 產(chǎn)品，含10%新生牛血清及100 U/mL青霉素和鏈霉素，過濾除菌，分裝，置4 ℃?zhèn)溆?；細胞維持液：1640細胞培養(yǎng)液，GIBCO 產(chǎn)品，含2%新生牛血清及100 U/mL青霉素和鏈霉素；PBS：Hyclone產(chǎn)品；細胞消化液：Hyclone產(chǎn)品。

儀器 酶標儀(Thermo公司)，倒置顯微鏡(CKX-31Olympus公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(隔水式，美國Forma公司)，生物安全柜(蘇凈集團安泰公司)，超低溫冰柜(-80 ℃，中科美菱公司)，冰箱(4 ℃、-20 ℃，海爾公司)，高速臺式離心機(TGL-16型，上海醫(yī)療器械六廠)。

2 方法

2.1 細胞的復蘇與傳代[8]2.2 接種96孔板單層細胞

當細胞在培養(yǎng)瓶內(nèi)長成單層，處于對數(shù)生長期的MA104細胞可進行接種。倒出培養(yǎng)瓶中舊的培養(yǎng)液，加入3 mLPBS沖洗2次，加入0.25%胰酶適量進行消化，細胞回縮，細胞之間間隙增大不接連成片時，加入3 mL培養(yǎng)液，輕輕拍打培養(yǎng)瓶，并用移液管吹打成單細胞懸液，計數(shù)，用培養(yǎng)液稀釋調(diào)整細胞密度為1×105/mL后，接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，待長成單層細胞。

2.3 病毒擴增與保存[9]2.4 病毒毒力測定[10]

根據(jù)Reed-Muench公式，計算病毒的半數(shù)細胞感染量(TCID50)。由計算可得RSV的TCID50為10-4.78。實驗時采用100個TCID50作為病毒液濃度[11]。

2.5 藥物對細胞毒性測定

棄去已長成單層細胞的96孔板中的培養(yǎng)液，將受試藥物用1640維持液按2倍比稀釋依次加于96孔板中，每個稀釋濃度平行3個孔，每孔100 μL。同時設(shè)正常細胞對照組，每孔加入1640維持液100 μL。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，每日觀察細胞病變，連續(xù)3天觀察藥物毒性，記錄細胞病變(CPE)百分率，CPE大于50%視為毒性。得到藥物半數(shù)中毒濃度(toxic concentration 50%,TC50) 和最大無毒濃度(TC0)。

2.6 藥物體外抗RSV試驗[10]

將受試藥物用細胞維持液從最大無毒濃度(TC0)開始做2倍比稀釋共12個濃度，橫向依次加入96孔板內(nèi)的單層MA104細胞上，每孔50 μL，設(shè)細胞對照、病毒對照，利巴韋林為陽性對照(10 mg/mL)，每個稀釋度重復3孔。除細胞對照外，各孔加入100個TCID50的病毒液50 μL。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察細胞病變，待病毒對照出現(xiàn)90%細胞病變，正常細胞對照生長為正常細胞形態(tài)。記錄細胞病變(CPE)百分率，CPE小于50%視為有效。得到其藥物半數(shù)有效濃度(concentration for 50% of maximal effect,EC50)。

2.7 數(shù)理統(tǒng)計與顯著性檢驗

本文表格中TC50、EC50由CPE觀察得出。采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行成對數(shù)據(jù)t檢驗,以α = 0.05為顯著性水準,判斷三葉青醇提物正丁醇萃取部分和乙酸乙酯萃取部分與陽性對照藥利巴韋林間是否存在顯著性差異。

3 結(jié)果

通過對三葉青乙醇提取物及其分別用正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取得到的不同活性部位和正丁醇部位經(jīng)大孔樹脂分離的水洗脫部位和不同濃度乙醇洗脫部位(30%、50%、70%、95%)、以及制備液相分離純化各階段得到的樣品和乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱層析、制備液相色譜分離純化各階段得到的樣品進行抗病毒活性篩選。

3.1 抗病毒實驗結(jié)果統(tǒng)計(正丁醇部位)

三葉青醇提物正丁醇萃取部分的抗RSV病毒實驗結(jié)果(治療指數(shù)TI)統(tǒng)計如下表1～3。

表1 正丁醇萃取部分粗提取液抗病毒實驗結(jié)果Table 1 Antiviral results of crude extracts from n-butanol extraction

注：TC50和EC50以96孔板中稀釋度表示。

Note:TC50andEC50were expressed in 96 hole plate dilution.

表2 正丁醇萃取部分各提取液洗脫部位抗病毒實驗結(jié)果Table 2 The results of antivirus on the eluting site of the extracts of n-butanol extraction

注：TC50和EC50以96孔板中稀釋度表示。

Note:TC50and EC50were expressed in 96 hole plate dilution.

表3 正丁醇萃取部分化合物抗病毒實驗結(jié)果Table 3 Antivirus results of n-butanol extract compounds

續(xù)表3(Continued Tab.3)

樣品SampleTC50EC50TI兒茶素(C3)Catechin2-32-68表兒茶素(C4)Epicatechin2-42-78山奈酚-7-O-鼠李糖-3-O-葡萄糖苷(C5)Kaempefent-3-O-glucopyranoside-7-O-rhamnopyranoside 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(C6)Quercetin-3-O-β-D-glucoside2-52-52-62-724槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖(C7)Quercetin-7-O-β-D-glucoside2-42-64山柰酚-3-0-蕓香糖苷(C8)Kaempferol-3-O-rutinoside2-42-52山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖(C9)Kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside2-52-88

注：TC50和EC50以96孔板中稀釋度表示。

Note:TC50and EC50were expressed in 96 hole plate dilution.

由三葉青正丁醇萃取部位分離純化各階段的抗病毒實驗結(jié)果可見，30%、50%、70%乙醇洗脫部位對呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用較強，進一步將30%、50%、70%乙醇洗脫部位分為30-1、30-2、30-3、30-4、50-1、50-2、50-3、50-4、70-1、70-2、70-3共11個部分，其中，30-2和30-3的抗病毒活性較強，此外70 %洗脫部分分離得到的70-2部分活性也較強；從表2的11個部分中，進一步分離純化并鑒定出的9個單體化合物(C1～C9)多數(shù)具有一定的抗病毒活性；隨著分離純化過程的進行，提取到的化合物抗病毒活性變?nèi)?，推測正丁醇部位可能是未提取分離得到的化合物在起作用，也可能是幾種乃至幾十種化合物協(xié)同作用的結(jié)果，或某些不穩(wěn)定的化合物導致。

3.2 抗病毒實驗結(jié)果統(tǒng)計(乙酸乙酯部位)

三葉青醇提物乙酸乙酯萃取部分的抗RSV病毒實驗結(jié)果(治療指數(shù)TI)見表4～ 6。

由乙酸乙酯部位抗病毒實驗結(jié)果可知，三葉青乙酸乙酯萃取液甲醇∶氯仿=100∶0洗脫部分，甲醇∶氯仿=100∶15洗脫部分，甲醇∶氯仿=100∶30洗脫部分均有一定的抗RSV病毒活性，進一步分離得到的氯0-2、氯0-3部分對RSV病毒作用較強；乙酸乙酯部分分離純化得到的化合物均有一定程度的抗病毒活性，總體上效果優(yōu)于正丁醇部分，其中C11(山柰酚)、C12(5,7,4′-三羥基-3′-甲氧基黃酮)和C13(槲皮素)對病毒的抑制作用較強；隨著分離純化過

表4 乙酸乙酯萃取部分粗提取液抗病毒實驗結(jié)果Table 4 Antiviral results of crude extracts from ethyl acetate extraction

注∶TC50和EC50以96孔板中稀釋度表示。

Note:TC50andEC50were expressed in 96 hole plate dilution.

表5 乙酸乙酯萃取部分各提取液洗脫部位抗病毒實驗結(jié)果Table 5 The results of antivirus on the eluting site of the extracts of ethyl acetate extraction

注：TC50和EC50以96孔板中稀釋度表示。

Note:TC50andEC50were expressed in 96 hole plate dilution.

表6 乙酸乙酯萃取部分化合物抗病毒實驗結(jié)果Table 6 Antivirus results of ethyl acetate extract compounds

注：TC50和EC50以96孔板中稀釋度表示。

Note:TC50andEC50were expressed in 96 hole plate dilution.

程的進行，提取物的活性也逐漸變?nèi)酰茰y乙酸乙酯部位的抗病毒活性可能是未知化合物或各種化合物協(xié)同作用的結(jié)果[12-18]，也可能有部分化合物不穩(wěn)定，在分離純化及抗病毒實驗過程中易氧化和被催化分解、或同其他化合物或試劑反應(yīng)。和正丁醇部位的抗病毒實驗結(jié)果類似，這些都有待于進一步的分離純化及藥理活性研究。

三葉青乙醇提取物正丁醇萃取部分和乙酸乙酯萃取部分對RSV的抗病毒效果均比陽性對照藥利巴韋林，EC50為0.008 g/mL,TI為6.25顯著(P<0.05)。三葉青提取物各部分對RSV均具有一定的抑制作用。其中，三葉青醇提物的正丁醇和乙酸乙酯萃取部分具有較為顯著的抗病毒活性，乙酸乙酯萃取部分在提取后期對病毒的作用較強，其抑毒效果可能是幾種化合物的協(xié)同作用或某些結(jié)構(gòu)不明抑或是不穩(wěn)定的化合物導致。

4 結(jié)論

現(xiàn)代藥理作用研究指出，三葉青具有抵抗病毒感染、調(diào)節(jié)自身免疫的藥理活性[19]。本實驗通過對三葉青乙醇提取物及其分別用正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取得到的不同活性部位和正丁醇部位經(jīng)大孔樹脂分離的水洗脫部位和不同濃度乙醇洗脫部位(30%、50%、70%、95%)、以及制備液相分離純化各階段得到的樣品和乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱層析、制備液相色譜分離純化各階段得到的樣品進行抗病毒活性篩選，從而得到三葉青的抗病毒活性部位，為三葉青在抗病毒領(lǐng)域的應(yīng)用、抗病毒成分的深入研究及闡明三葉青抗RSV的作用機理，提供可靠的理論數(shù)據(jù)。