枸杞色素及多糖的不同提取次序?qū)ζ涞寐始翱寡趸钚缘挠绊?/h1>
2019-06-25 09:03李文君王成章葉建中季金金
天然產(chǎn)物研究與開發(fā) 2019年6期
李文君，王成章*，葉建中，季金金
1中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；2南京林業(yè)大學(xué)化工學(xué)院， 南京 210042
枸杞屬植物枸杞(LyciumbarbarumL.)為多棘刺落葉小灌木，具有很強(qiáng)的抗旱能力，在我國(guó)的寧夏、青海、甘肅、新疆等地分布較廣。其漿果枸杞子在《神農(nóng)本草經(jīng)》中引為上品，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，素有“紅寶”美稱[1]。其味甘、性平，有清肝、潤(rùn)肺、滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、抗癌的功效，既含有碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、核黃素、胡蘿卜素、磷、鈣、鐵、鋅，還含有多種維生素及玉蜀黍黃素[2]。21世紀(jì)初就開始了枸杞子的有效成分與藥理學(xué)的研究，現(xiàn)代醫(yī)藥表明，枸杞子中含有的甜菜堿、枸杞色素和枸杞多糖為枸杞子的主要活性物質(zhì)。其中，枸杞色素為枸杞漿果中各種呈色物質(zhì)的總稱，主要成分是類胡蘿卜素及其酯，具有消炎、抗疲勞、抗氧化、延緩衰老和預(yù)防腫瘤等重要的生物學(xué)功能，是食品和化妝品天然的著色物質(zhì)。枸杞多糖(LBP)是由多個(gè)單糖或衍生物聚合而成的大分子活性化合物，其結(jié)構(gòu)按LBP-I、LBP-II、LBP-III、LBP-IV的順序水溶性依次遞減，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑[3]，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[4]，控制腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞突變，延緩衰老，提高適應(yīng)能力，并具有抗疲勞和加速消除疲勞作用[5,6]，已成為保健食品的一種重要功能性添加劑而且顯示出良好的應(yīng)用前景。目前，枸杞色素作為食用色素其提取方法主要有水浸提、有機(jī)溶劑浸提、皂化提取、微波或者超聲處理、超臨界流體萃取等，而其多糖的提取方法主要有水提法、堿液提取法、酶解提取法、微波法、超聲波萃取法等[7]，所以枸杞色素和多糖在提取方式上有相似之處，故當(dāng)對(duì)同一批樣品，即提取枸杞色素又提取枸杞多糖，就可能會(huì)對(duì)兩者的含量造成影響，但是，目前這一方面的研究國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道。因此，本文將通過實(shí)驗(yàn)論證這一點(diǎn)，通過不同提取次序考察其對(duì)枸杞多糖和色素的得率及其抗氧化活性的影響，這將為枸杞子中色素和多糖后續(xù)同批次的綜合加工利用提供一定的參考。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 原料
寧夏枸杞子，60 ℃烘干后，放入干燥器中冷卻24 h，研碎過200目篩得枸杞粉，4 ℃干燥保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.2 試劑
乙醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、環(huán)己烷均為分析級(jí)，正己烷為色譜級(jí)。
1.1.3 儀器
數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-6，國(guó)華電器有限公司；實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)，F(xiàn)A2004，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；恒溫干燥箱，XMTD-8222，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，UV765，上海怡電儀器公司。
1.2 方法
1.2.1 枸杞色素的提取工藝探究
1.2.1.1 枸杞色素提取率分析方法的建立
由于枸杞色素的主要成分為脂溶性類胡蘿卜素類化合物，故本實(shí)驗(yàn)中對(duì)枸杞色素的提取率分析以β-胡蘿卜素為指標(biāo)，故需要測(cè)定的其標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：
稱10.0 mg的β-胡蘿卜素于25 mL的容量瓶中，正己烷定容至刻度線，配制4.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL的容量瓶中，正己烷定容至刻度線，分別得濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL的溶液，以蒸餾水同法做空白參比，在其最大吸收波長(zhǎng)448 nm下的吸光度值A(chǔ)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)y，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.187 8x+0.011 11,R2=0.997 8。
圖1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 β-carotene standard curve
1.2.1.2 枸杞色素的提取
枸杞色素的提取過程是利用索氏提取器熱回流進(jìn)行，主要提取其中的脂溶性色素，分別考察了提取溶劑、提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比等因素對(duì)枸杞色素提取率的影響，基本方法為：稱取10 g的枸杞粉末置于圓底燒杯中，加入100 g的石油醚溶液，于80 ℃水浴鍋中加熱進(jìn)行索式提取，1 h后過濾，殘?jiān)性俅蔚谷?00 g的石油醚繼續(xù)提取1 h，將兩次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值。
1.2.2 枸杞多糖的提取工藝探究
1.2.2.1 枸杞多糖的分析方法的建立
枸杞多糖是一種水溶性多糖，在枸杞中含量約為7.09%，已明確該多糖系蛋白多糖，分析枸杞多糖的提取率，以α-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為指標(biāo)，故需要測(cè)定的其標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：
采用苯酚-硫酸比色法[8]，α-無水葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，在485 nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)y，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8.713 9x-0.043 9，R2=0.993 5。
圖2 α-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 α-anhydrous glucose standard curve
1.2.2.2 傳統(tǒng)工藝提取枸杞多糖
取10 g枸杞粉置于普通回流裝置中，加入氯仿與甲醇混合溶劑(氯仿∶甲醇=2∶1)，在60 ℃回流脫脂2次，每次2 h，濾出溶劑，殘?jiān)L(fēng)干后取80%乙醇適量，60℃回流2次，每次2 h，回收乙醇，再以50～60 ℃水提2次，共4 h，液固比為1∶15～1∶30[9]，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)[10]，即得固形物枸杞多糖粗粉。
1.2.2.3 水提取枸杞多糖
取10 g枸杞粉置于普通回流裝置中，加入超純水回流2次，每次2 h，液固比為1∶15～1∶30，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得固形物枸杞多糖粗粉。
1.2.2.4 超聲輔助提取枸杞多糖[11]
取10 g枸杞粉置于100 mL燒杯中，加適量超純水超聲提取2次，每次30 min，過濾，濾液于50～70 ℃濃縮，最后用95%乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得枸杞多糖粗粉。
1.3 枸杞色素、枸杞多糖的抗氧化活性研究[12-16]
1.3.1 枸杞色素、枸杞多糖對(duì)DPPH·的清除能力
DPPH·的單電子，在510 nm處有強(qiáng)吸收，且其乙醇水溶液呈紫色，加入待測(cè)物后，通過檢測(cè)其在該波長(zhǎng)下的吸光度值的變化，利用公式(1)計(jì)算出DPPH·的清除率，以此評(píng)價(jià)待測(cè)物的抗氧化活性能力。
分別取4 mL濃度為0.025 mg/mL的DPPH·的乙醇溶液，加入6支試管中，依次加入0.2 mL濃度為0、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mg/mL的枸杞色素、枸杞多糖和抗壞血酸(Vc)溶液立即搖勻，在室溫遮光反應(yīng)30 min，然后利用紫外可見光分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)下，檢測(cè)其吸光度值：
DPPH·清除率(S%)=(1-A30/A0)×100%
(1)
其中，A30是指分別加入了枸杞色素、枸杞多糖和Vc并反應(yīng)30 min后溶液體系的吸光度值，A0是指體系未加入枸杞色素、枸杞多糖和Vc時(shí)溶液體系的吸光度值。
1.3.2 枸杞色素、枸杞多糖對(duì)·OH的清除能力
將H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生的·OH，可與體系中的水楊酸結(jié)合生成紫色物質(zhì)，在530 nm波長(zhǎng)下具有最大吸收峰。加入待測(cè)物后，通過檢測(cè)其在該波長(zhǎng)下的吸光度值的變化，利用公式(2)計(jì)算出DPPH·的清除率，以此評(píng)價(jià)待測(cè)物的抗氧化活性能力。
分別量取2 mL濃度為9 mmol/L 的FeSO4溶液和2 mL濃度為9 mmol/L的H2O2溶液，加入6支試管中，依次加入0.2 mL濃度為0、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mg/mL的枸杞色素、枸杞多糖和抗壞血酸(Vc)溶液，搖勻，靜置10 min，再加入2 mL的9 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，在37 ℃下反應(yīng)30 min，以超純水作為參比，然后利用紫外可見光分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)下，檢測(cè)其吸光度值：
·OH清除率(S%)=1-[(AX-AX0)/A0]×100%
(2)
其中，A0為空白對(duì)照的吸光度值，AX為加入樣品溶液的吸光度值，AX0為不加顯色劑H2O2的吸光度值。
2 結(jié)果與討論
2.1 枸杞色素的提取工藝研究
2.1.1 不同提取溶劑對(duì)枸杞色素得率的影響
利用1.2.1.2的方法，考察不同提取溶劑如石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷、正己烷、乙醇、80%乙醇等對(duì)枸杞色素得率的影響，料液比1∶10，于80 ℃下索式提取2次，每次1 h，僅改變提取溶劑，將兩次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(A)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，三氯甲烷和正己烷溶劑對(duì)枸杞色素得率的影響相差無幾，但是考慮到安全性和經(jīng)濟(jì)性，本實(shí)驗(yàn)采用正己烷進(jìn)行提取枸杞色素。
圖3 提取溶劑對(duì)枸杞色素得率的影響Fig.3 Effect of different factors on the yield of Lycium barbarum pigment
2.1.2 不同提取次數(shù)對(duì)枸杞色素得率的影響
利用1.2.1.2的方法，考察不同的提取次數(shù)如提取1、2、3、4和5次對(duì)枸杞色素得率的影響，以正己烷為提取溶劑，料液比1∶10，于80 ℃下索式提取，僅改變提取次數(shù)，將每次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(B)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取次數(shù)為2次時(shí)，枸杞色素的得率最高，因此，本實(shí)驗(yàn)的提取次數(shù)為2次。
2.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)枸杞色素得率的影響
利用1.2.1.2的方法，考察提取時(shí)間如提取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 h對(duì)枸杞色素得率的影響，故以正己烷為提取溶劑，料液比1∶10，于80 ℃下索式提取2次，僅改變提取時(shí)間，將兩次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(C)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在提取時(shí)間為1.5 h時(shí)枸杞色素得率較高，但與提取時(shí)間為1 h時(shí)的枸杞色素得率相差不大，考慮到經(jīng)濟(jì)問題，在本實(shí)驗(yàn)中選擇提取時(shí)間為1 h。
2.1.4 不同料液比對(duì)枸杞色素得率的影響
利用1.2.1.2的方法，考察不同料液比如料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25對(duì)枸杞色素得率的影響，故以正己烷為提取溶劑，提取2次，每次1 h，于80 ℃下索式提取2次，每次1 h，僅改變料液比，將兩次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，其余試驗(yàn)條件不變，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(D)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，料液比在1∶10時(shí)枸杞色素得率最高，因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)過程選擇1∶10料液比進(jìn)行。
2.1.5 不同提取溫度對(duì)枸杞色素得率的影響
利用1.2.1.2的方法，考察不同提取溫度如75、80、85、90 ℃對(duì)枸杞色素得率的影響，故以正己烷為提取溶劑，提取2次，每次1 h，料液比1∶10時(shí)，僅改變提取溫度，將兩次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(E)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取溫度為80 ℃時(shí)，枸杞色素得率最高，因此本實(shí)驗(yàn)后續(xù)過程選擇提取溫度為80 ℃。
2.1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)
綜上所述，枸杞色素的提取工藝為以正己烷為提取溶劑，提取2次，每次1 h，料液比1∶10，提取溫度為80 ℃，色素得率較高。因此，為了驗(yàn)證該條件的正確性，在此條件下進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，得其枸杞色素的得率分別為3.8%、3.9%、4.1%，平均得率為3.93%。
2.2 枸杞多糖提取工藝研究
在本部分實(shí)驗(yàn)中的枸杞子原料粉末為首先利用2.1.6中的最佳條件將枸杞色素提取出來后的烘干的料渣，故本部分試驗(yàn)是先提取后枸杞色素后再進(jìn)行提取枸杞多糖。
2.2.1 不同提取工藝對(duì)枸杞多糖得率的影響
圖4 不同因素對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.4 Effect of different factors on the yield of Lycium barbarum polysaccharides
利用1.2.2.2和1.2.2.3的方法，考察不同提取工藝如傳統(tǒng)工藝提取方法、普通水提取和索式水提法對(duì)枸杞多糖得率的影響，其余條件如料液比、提取時(shí)間、提取溫度等都相同，測(cè)定其中多糖含量時(shí)，首先將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(A)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在傳統(tǒng)脫脂法、普通水提法和索式水提法三種工藝過程中，索式水提法得到的枸杞多糖較多，因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將采用索式水提法進(jìn)行。
2.2.2 不同料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.3的方法，考察不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30對(duì)枸杞多糖的影響，利用索式水提法，僅改變料液比，于90 ℃下索式提取2次，每次2 h，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得固形物枸杞多糖粗粉。測(cè)定其中多糖含量時(shí)，首先將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(B)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)對(duì)枸杞多糖得率的影響最顯著，因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將采用1∶15的料液比進(jìn)行。
2.2.3 不同提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.3的方法，考察不同提取時(shí)間如1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 h對(duì)枸杞多糖得率的影響，利用索式水提法，料液比為1∶15，于90 ℃下索式提取2次，僅改變提取時(shí)間，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得固形物枸杞多糖粗粉。測(cè)定其中多糖含量時(shí)，首先將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(C)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取時(shí)間在1.5 h時(shí)最佳。
2.2.4 不同提取次數(shù)對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.3的方法，考察考察不同提取次數(shù)如提取1次、2次、3次、4次對(duì)枸杞多糖得率的影響，利用索式水提法，料液比為1∶15，提取時(shí)間為1.5 h，于90 ℃下索式提取，僅改變提取次數(shù)，每次2 h，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得固形物枸杞多糖粗粉。測(cè)定其中多糖含量時(shí)，首先將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(D)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取2次時(shí)枸杞多糖的得率最高，因此，后續(xù)工作中提取2次。
2.2.5 不同提取溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.3中方法，考察不同提取溫度如85、90、95、100 ℃對(duì)枸杞多糖得率的影響，利用索式水提法，料液比為1∶15，僅改變提取溫度，提取時(shí)間為1.5 h，提取2次，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得固形物枸杞多糖粗粉。測(cè)定其中多糖含量時(shí)，首先將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(E)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取溫度為100 ℃時(shí)，提取效果最佳。
2.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)
綜上所述，枸杞多糖以索式水提時(shí)，料液比為1∶15，提取時(shí)間為1.5 h，提取2次，提取溫度為100 ℃時(shí)，多糖得率較高。因此，為了驗(yàn)證該條件的正確性，在此條件下進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，枸杞多糖的得率分別為4.28%、4.46%、4.09%，平均得率為4.28%。
2.3 超聲提取法提取枸杞多糖
同上，在本部分實(shí)驗(yàn)中的枸杞子原料粉末也是為首先利用2.1.6中的最佳條件將枸杞色素提取出來后的烘干的料渣，故本部分試驗(yàn)是先提取枸杞色素后再進(jìn)行提取枸杞多糖。
2.3.1 不同超聲時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響
圖5 不同超聲時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic factors on the yield of Lycium barbarum polysaccharides
利用1.2.2.4的方法，考察不同超聲時(shí)間如10、20、30、40、50、60 min時(shí)對(duì)枸杞多糖得率的影響，料液比1∶10，20%超聲功率(最大功率1 200 W)下超聲2次，僅改變超聲時(shí)間，過濾，濾液于50～70 ℃濃縮，最后用95%乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得枸杞多糖粗粉。將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(A)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，超聲20 min時(shí)，提取的效果最佳。
2.3.2 不同超聲功率對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.4的方法，考察不同超聲功率如10%、15%、20%、25%、30%對(duì)枸杞多糖得率的影響，僅改變超聲功率，料液比1∶10，超聲2次，每次20 min，過濾，濾液于50～70 ℃濃縮，最后用95%乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得枸杞多糖粗粉。將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(B)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，超聲效率25%時(shí)，超聲提取多糖的效果最佳。
2.3.3 不同料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.4的方法，考察不同超聲料液比如1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30對(duì)枸杞多糖得率的影響，僅改變料液比，25%超聲功率下每次超聲2次，每次20 min，過濾，濾液于50～70 ℃濃縮，最后用95%乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得枸杞多糖粗粉。將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(C)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，超聲料液比1∶10的條件下，超聲提取的效果最佳。
2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)
綜上所述，枸杞多糖以超聲水提時(shí)，超聲20 min，超聲功率25%，料液比為1∶10，多糖得率較高。因此，為了驗(yàn)證該條件的正確性，在此條件下進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，得其枸杞多糖的得率分別為5.35%，5.26%，5.08%，平均得率為5.23%。
2.4 枸杞多糖提取后枸杞色素的提取
由上可知，枸杞多糖的最佳提取條件為超聲水提，可能是枸杞色素由于枸杞子已經(jīng)過高溫提取而損失，但超聲又使枸杞子細(xì)胞進(jìn)一步的充分破碎，且超聲產(chǎn)生的熱量又促使枸杞多糖溶解，因此在此條件下，超聲水提法(5.23%)提取得到的枸杞多糖得率高于索氏水提(4.28%)。經(jīng)超聲水提未經(jīng)處理過的枸杞子，然后再利用枸杞色素提取的最佳條件進(jìn)行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此時(shí)枸杞多糖的平均得率為7.45%，而枸杞色素的平均得率為2.48%。
2.5 不同提取次序?qū)﹁坭缴睾丸坭蕉嗵强寡趸钚缘挠绊?/h3>
考察不同提取提取次序?qū)﹁坭缴睾丸坭蕉嗵强寡趸钚缘挠绊懀ㄟ^相同濃度下的枸杞色素、枸杞多糖和Vc對(duì)DPPH·和·OH的自由基清除率來確定，由于提取次序不同，不僅造成了先提取的枸杞色素和枸杞多糖分別比后提取的得率高，也會(huì)由于提取過程的影響對(duì)不同提取次序下的枸杞色素和枸杞多糖產(chǎn)生影響。具體結(jié)果如圖6所示：其中，枸杞色素1和枸杞多糖2分別代表先提枸杞色素然后再提的枸杞多糖，而枸杞色素2和枸杞多糖1則代表先提的枸杞多糖然后再提的枸杞色素。圖6表明，在同樣溶液濃度下，Vc對(duì)DPPH·和·OH的自由基清除率基本都是最大的，而枸杞色素和枸杞多糖則隨著濃度的升高，抗氧化活性逐漸增強(qiáng)，尤其是枸杞色素1在濃度升高到0.60 mg/mL及更高時(shí)，對(duì)DPPH·自由基的清除能力十分接近Vc。另外，圖6(A)和(B)均可發(fā)現(xiàn)，不同提取次序?qū)τ阼坭缴睾投嗵堑挠绊懖煌?，?duì)枸杞多糖的影響不大，但對(duì)枸杞色素的影響比較大，這可是能在先提取枸杞多糖時(shí)，所用溶劑把枸杞色素上的脂質(zhì)保護(hù)膜部分的破壞掉了，導(dǎo)致色素部分氧化造成的。同樣條件下，枸杞色素的抗氧化活性較枸杞多糖的強(qiáng)，所以枸杞色素受影響的情況較為明顯一點(diǎn)?？傮w上，枸杞色素1和枸杞多糖1對(duì)DPPH·自由基清除率都較高，枸杞多糖1對(duì)·OH自由基清除率都較高，其抗氧化活性接近Vc。
3 結(jié)論
綜上，在以正己烷為提取溶劑，提取2次，每次1 h，料液比1∶10，提取溫度為80 ℃時(shí)，可得到3.93%的枸杞色素，然后料渣通過超聲水提，在超聲20 min，超聲功率25%，料液比為1∶10的條件下可得到5.23%的枸杞多糖。改變提取順序，在同樣的提取條件下，可分別得到7.45%的枸杞多糖，2.48%的枸杞色素。因?yàn)殍坭蕉嗵鞘且环N易溶于熱水或稀酸、稀堿溶液，能被乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑析出的蛋白多糖，超聲提取法提取時(shí)，超聲波能夠破碎植物的細(xì)胞壁，從而可大幅度提高有效成分提取率。而枸杞色素則由于其本身性質(zhì)的不穩(wěn)定性，在先提取枸杞多糖時(shí)也會(huì)將枸杞色素部分的溶解出去，故后提取枸杞色素時(shí)其得率較低。同時(shí)，提取次序的改變對(duì)于枸杞色素和枸杞多糖的抗氧化活性都有一定的影響，但對(duì)枸杞色素的影響更大一點(diǎn)?？傮w上，枸杞色素1和枸杞多糖1對(duì)DPPH·自由基清除率都較高，枸杞多糖1對(duì)·OH自由基清除率都較高，其抗氧化活性接近Vc。在后續(xù)的研究中，將對(duì)多個(gè)提取條件的交互效應(yīng)以及提取次序的改變對(duì)其他成分的改變和影響進(jìn)行更多的深入研究。
圖6 枸杞色素、枸杞多糖及Vc的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of Lycium barbarum pigment,Lycium barbarum polysaccharide and Vc
猜你喜歡
下期要目化工設(shè)計(jì)(2022年4期)2023-01-02 一種基于SOM神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中藥材分類識(shí)別系統(tǒng)電子測(cè)試(2022年16期)2022-10-17 正己烷在不同硅鋁比HZSM-5分子篩上吸附的分子模擬研究石油煉制與化工(2022年2期)2022-02-15 長(zhǎng)填齡滲濾液MBR+NF組合工藝各處理單元的DOM化學(xué)多樣性環(huán)境衛(wèi)生工程(2021年3期)2021-07-21 不同填埋年齡期垃圾滲濾液對(duì)HDPE管材結(jié)垢影響環(huán)境科學(xué)研究(2021年5期)2021-05-20 滲濾液短程硝化-厭氧氨氧化工藝深度脫氮及機(jī)理研究環(huán)境衛(wèi)生工程(2021年1期)2021-03-19 垃圾滲濾液處理調(diào)試期間NF膜通量下降原因及優(yōu)化環(huán)境衛(wèi)生工程(2021年1期)2021-03-19 江西省硬質(zhì)合金企業(yè)正己烷的職業(yè)健康風(fēng)險(xiǎn)控制化工管理(2021年31期)2021-01-09 乘用車后回復(fù)反射器光度性能試驗(yàn)研究汽車電器(2019年1期)2019-03-21 皎皎月光花火A(2018年9期)2018-11-26
李文君，王成章*，葉建中，季金金
1中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；2南京林業(yè)大學(xué)化工學(xué)院， 南京 210042
枸杞屬植物枸杞(LyciumbarbarumL.)為多棘刺落葉小灌木，具有很強(qiáng)的抗旱能力，在我國(guó)的寧夏、青海、甘肅、新疆等地分布較廣。其漿果枸杞子在《神農(nóng)本草經(jīng)》中引為上品，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，素有“紅寶”美稱[1]。其味甘、性平，有清肝、潤(rùn)肺、滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、抗癌的功效，既含有碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、核黃素、胡蘿卜素、磷、鈣、鐵、鋅，還含有多種維生素及玉蜀黍黃素[2]。21世紀(jì)初就開始了枸杞子的有效成分與藥理學(xué)的研究，現(xiàn)代醫(yī)藥表明，枸杞子中含有的甜菜堿、枸杞色素和枸杞多糖為枸杞子的主要活性物質(zhì)。其中，枸杞色素為枸杞漿果中各種呈色物質(zhì)的總稱，主要成分是類胡蘿卜素及其酯，具有消炎、抗疲勞、抗氧化、延緩衰老和預(yù)防腫瘤等重要的生物學(xué)功能，是食品和化妝品天然的著色物質(zhì)。枸杞多糖(LBP)是由多個(gè)單糖或衍生物聚合而成的大分子活性化合物，其結(jié)構(gòu)按LBP-I、LBP-II、LBP-III、LBP-IV的順序水溶性依次遞減，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑[3]，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[4]，控制腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞突變，延緩衰老，提高適應(yīng)能力，并具有抗疲勞和加速消除疲勞作用[5,6]，已成為保健食品的一種重要功能性添加劑而且顯示出良好的應(yīng)用前景。目前，枸杞色素作為食用色素其提取方法主要有水浸提、有機(jī)溶劑浸提、皂化提取、微波或者超聲處理、超臨界流體萃取等，而其多糖的提取方法主要有水提法、堿液提取法、酶解提取法、微波法、超聲波萃取法等[7]，所以枸杞色素和多糖在提取方式上有相似之處，故當(dāng)對(duì)同一批樣品，即提取枸杞色素又提取枸杞多糖，就可能會(huì)對(duì)兩者的含量造成影響，但是，目前這一方面的研究國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道。因此，本文將通過實(shí)驗(yàn)論證這一點(diǎn)，通過不同提取次序考察其對(duì)枸杞多糖和色素的得率及其抗氧化活性的影響，這將為枸杞子中色素和多糖后續(xù)同批次的綜合加工利用提供一定的參考。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 原料
寧夏枸杞子，60 ℃烘干后，放入干燥器中冷卻24 h，研碎過200目篩得枸杞粉，4 ℃干燥保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.2 試劑
乙醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、環(huán)己烷均為分析級(jí)，正己烷為色譜級(jí)。
1.1.3 儀器
數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-6，國(guó)華電器有限公司；實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)，F(xiàn)A2004，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；恒溫干燥箱，XMTD-8222，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，UV765，上海怡電儀器公司。
1.2 方法
1.2.1 枸杞色素的提取工藝探究
1.2.1.1 枸杞色素提取率分析方法的建立
由于枸杞色素的主要成分為脂溶性類胡蘿卜素類化合物，故本實(shí)驗(yàn)中對(duì)枸杞色素的提取率分析以β-胡蘿卜素為指標(biāo)，故需要測(cè)定的其標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：
稱10.0 mg的β-胡蘿卜素于25 mL的容量瓶中，正己烷定容至刻度線，配制4.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL的容量瓶中，正己烷定容至刻度線，分別得濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL的溶液，以蒸餾水同法做空白參比，在其最大吸收波長(zhǎng)448 nm下的吸光度值A(chǔ)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)y，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.187 8x+0.011 11,R2=0.997 8。
圖1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 β-carotene standard curve
1.2.1.2 枸杞色素的提取
枸杞色素的提取過程是利用索氏提取器熱回流進(jìn)行，主要提取其中的脂溶性色素，分別考察了提取溶劑、提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比等因素對(duì)枸杞色素提取率的影響，基本方法為：稱取10 g的枸杞粉末置于圓底燒杯中，加入100 g的石油醚溶液，于80 ℃水浴鍋中加熱進(jìn)行索式提取，1 h后過濾，殘?jiān)性俅蔚谷?00 g的石油醚繼續(xù)提取1 h，將兩次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值。
1.2.2 枸杞多糖的提取工藝探究
1.2.2.1 枸杞多糖的分析方法的建立
枸杞多糖是一種水溶性多糖，在枸杞中含量約為7.09%，已明確該多糖系蛋白多糖，分析枸杞多糖的提取率，以α-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為指標(biāo)，故需要測(cè)定的其標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：
采用苯酚-硫酸比色法[8]，α-無水葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，在485 nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)y，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8.713 9x-0.043 9，R2=0.993 5。
圖2 α-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 α-anhydrous glucose standard curve
1.2.2.2 傳統(tǒng)工藝提取枸杞多糖
取10 g枸杞粉置于普通回流裝置中，加入氯仿與甲醇混合溶劑(氯仿∶甲醇=2∶1)，在60 ℃回流脫脂2次，每次2 h，濾出溶劑，殘?jiān)L(fēng)干后取80%乙醇適量，60℃回流2次，每次2 h，回收乙醇，再以50～60 ℃水提2次，共4 h，液固比為1∶15～1∶30[9]，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)[10]，即得固形物枸杞多糖粗粉。
1.2.2.3 水提取枸杞多糖
取10 g枸杞粉置于普通回流裝置中，加入超純水回流2次，每次2 h，液固比為1∶15～1∶30，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得固形物枸杞多糖粗粉。
1.2.2.4 超聲輔助提取枸杞多糖[11]
取10 g枸杞粉置于100 mL燒杯中，加適量超純水超聲提取2次，每次30 min，過濾，濾液于50～70 ℃濃縮，最后用95%乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得枸杞多糖粗粉。
1.3 枸杞色素、枸杞多糖的抗氧化活性研究[12-16]
1.3.1 枸杞色素、枸杞多糖對(duì)DPPH·的清除能力
DPPH·的單電子，在510 nm處有強(qiáng)吸收，且其乙醇水溶液呈紫色，加入待測(cè)物后，通過檢測(cè)其在該波長(zhǎng)下的吸光度值的變化，利用公式(1)計(jì)算出DPPH·的清除率，以此評(píng)價(jià)待測(cè)物的抗氧化活性能力。
分別取4 mL濃度為0.025 mg/mL的DPPH·的乙醇溶液，加入6支試管中，依次加入0.2 mL濃度為0、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mg/mL的枸杞色素、枸杞多糖和抗壞血酸(Vc)溶液立即搖勻，在室溫遮光反應(yīng)30 min，然后利用紫外可見光分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)下，檢測(cè)其吸光度值：
DPPH·清除率(S%)=(1-A30/A0)×100%
(1)
其中，A30是指分別加入了枸杞色素、枸杞多糖和Vc并反應(yīng)30 min后溶液體系的吸光度值，A0是指體系未加入枸杞色素、枸杞多糖和Vc時(shí)溶液體系的吸光度值。
1.3.2 枸杞色素、枸杞多糖對(duì)·OH的清除能力
將H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生的·OH，可與體系中的水楊酸結(jié)合生成紫色物質(zhì)，在530 nm波長(zhǎng)下具有最大吸收峰。加入待測(cè)物后，通過檢測(cè)其在該波長(zhǎng)下的吸光度值的變化，利用公式(2)計(jì)算出DPPH·的清除率，以此評(píng)價(jià)待測(cè)物的抗氧化活性能力。
分別量取2 mL濃度為9 mmol/L 的FeSO4溶液和2 mL濃度為9 mmol/L的H2O2溶液，加入6支試管中，依次加入0.2 mL濃度為0、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mg/mL的枸杞色素、枸杞多糖和抗壞血酸(Vc)溶液，搖勻，靜置10 min，再加入2 mL的9 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，在37 ℃下反應(yīng)30 min，以超純水作為參比，然后利用紫外可見光分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)下，檢測(cè)其吸光度值：
·OH清除率(S%)=1-[(AX-AX0)/A0]×100%
(2)
其中，A0為空白對(duì)照的吸光度值，AX為加入樣品溶液的吸光度值，AX0為不加顯色劑H2O2的吸光度值。
2 結(jié)果與討論
2.1 枸杞色素的提取工藝研究
2.1.1 不同提取溶劑對(duì)枸杞色素得率的影響
利用1.2.1.2的方法，考察不同提取溶劑如石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷、正己烷、乙醇、80%乙醇等對(duì)枸杞色素得率的影響，料液比1∶10，于80 ℃下索式提取2次，每次1 h，僅改變提取溶劑，將兩次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(A)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，三氯甲烷和正己烷溶劑對(duì)枸杞色素得率的影響相差無幾，但是考慮到安全性和經(jīng)濟(jì)性，本實(shí)驗(yàn)采用正己烷進(jìn)行提取枸杞色素。
圖3 提取溶劑對(duì)枸杞色素得率的影響Fig.3 Effect of different factors on the yield of Lycium barbarum pigment
2.1.2 不同提取次數(shù)對(duì)枸杞色素得率的影響
利用1.2.1.2的方法，考察不同的提取次數(shù)如提取1、2、3、4和5次對(duì)枸杞色素得率的影響，以正己烷為提取溶劑，料液比1∶10，于80 ℃下索式提取，僅改變提取次數(shù)，將每次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(B)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取次數(shù)為2次時(shí)，枸杞色素的得率最高，因此，本實(shí)驗(yàn)的提取次數(shù)為2次。
2.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)枸杞色素得率的影響
利用1.2.1.2的方法，考察提取時(shí)間如提取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 h對(duì)枸杞色素得率的影響，故以正己烷為提取溶劑，料液比1∶10，于80 ℃下索式提取2次，僅改變提取時(shí)間，將兩次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(C)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在提取時(shí)間為1.5 h時(shí)枸杞色素得率較高，但與提取時(shí)間為1 h時(shí)的枸杞色素得率相差不大，考慮到經(jīng)濟(jì)問題，在本實(shí)驗(yàn)中選擇提取時(shí)間為1 h。
2.1.4 不同料液比對(duì)枸杞色素得率的影響
利用1.2.1.2的方法，考察不同料液比如料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25對(duì)枸杞色素得率的影響，故以正己烷為提取溶劑，提取2次，每次1 h，于80 ℃下索式提取2次，每次1 h，僅改變料液比，將兩次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，其余試驗(yàn)條件不變，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(D)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，料液比在1∶10時(shí)枸杞色素得率最高，因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)過程選擇1∶10料液比進(jìn)行。
2.1.5 不同提取溫度對(duì)枸杞色素得率的影響
利用1.2.1.2的方法，考察不同提取溫度如75、80、85、90 ℃對(duì)枸杞色素得率的影響，故以正己烷為提取溶劑，提取2次，每次1 h，料液比1∶10時(shí)，僅改變提取溫度，將兩次的濾液濃縮，在25 mL容量瓶中加入正己烷定容至刻度，繼續(xù)稀釋500倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(E)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取溫度為80 ℃時(shí)，枸杞色素得率最高，因此本實(shí)驗(yàn)后續(xù)過程選擇提取溫度為80 ℃。
2.1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)
綜上所述，枸杞色素的提取工藝為以正己烷為提取溶劑，提取2次，每次1 h，料液比1∶10，提取溫度為80 ℃，色素得率較高。因此，為了驗(yàn)證該條件的正確性，在此條件下進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，得其枸杞色素的得率分別為3.8%、3.9%、4.1%，平均得率為3.93%。
2.2 枸杞多糖提取工藝研究
在本部分實(shí)驗(yàn)中的枸杞子原料粉末為首先利用2.1.6中的最佳條件將枸杞色素提取出來后的烘干的料渣，故本部分試驗(yàn)是先提取后枸杞色素后再進(jìn)行提取枸杞多糖。
2.2.1 不同提取工藝對(duì)枸杞多糖得率的影響
圖4 不同因素對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.4 Effect of different factors on the yield of Lycium barbarum polysaccharides
利用1.2.2.2和1.2.2.3的方法，考察不同提取工藝如傳統(tǒng)工藝提取方法、普通水提取和索式水提法對(duì)枸杞多糖得率的影響，其余條件如料液比、提取時(shí)間、提取溫度等都相同，測(cè)定其中多糖含量時(shí)，首先將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(A)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在傳統(tǒng)脫脂法、普通水提法和索式水提法三種工藝過程中，索式水提法得到的枸杞多糖較多，因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將采用索式水提法進(jìn)行。
2.2.2 不同料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.3的方法，考察不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30對(duì)枸杞多糖的影響，利用索式水提法，僅改變料液比，于90 ℃下索式提取2次，每次2 h，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得固形物枸杞多糖粗粉。測(cè)定其中多糖含量時(shí)，首先將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(B)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)對(duì)枸杞多糖得率的影響最顯著，因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將采用1∶15的料液比進(jìn)行。
2.2.3 不同提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.3的方法，考察不同提取時(shí)間如1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 h對(duì)枸杞多糖得率的影響，利用索式水提法，料液比為1∶15，于90 ℃下索式提取2次，僅改變提取時(shí)間，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得固形物枸杞多糖粗粉。測(cè)定其中多糖含量時(shí)，首先將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(C)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取時(shí)間在1.5 h時(shí)最佳。
2.2.4 不同提取次數(shù)對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.3的方法，考察考察不同提取次數(shù)如提取1次、2次、3次、4次對(duì)枸杞多糖得率的影響，利用索式水提法，料液比為1∶15，提取時(shí)間為1.5 h，于90 ℃下索式提取，僅改變提取次數(shù)，每次2 h，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得固形物枸杞多糖粗粉。測(cè)定其中多糖含量時(shí)，首先將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(D)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取2次時(shí)枸杞多糖的得率最高，因此，后續(xù)工作中提取2次。
2.2.5 不同提取溫度對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.3中方法，考察不同提取溫度如85、90、95、100 ℃對(duì)枸杞多糖得率的影響，利用索式水提法，料液比為1∶15，僅改變提取溫度，提取時(shí)間為1.5 h，提取2次，合并濾液濃縮至20 mL左右，以4～5倍95%的乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得固形物枸杞多糖粗粉。測(cè)定其中多糖含量時(shí)，首先將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(E)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取溫度為100 ℃時(shí)，提取效果最佳。
2.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)
綜上所述，枸杞多糖以索式水提時(shí)，料液比為1∶15，提取時(shí)間為1.5 h，提取2次，提取溫度為100 ℃時(shí)，多糖得率較高。因此，為了驗(yàn)證該條件的正確性，在此條件下進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，枸杞多糖的得率分別為4.28%、4.46%、4.09%，平均得率為4.28%。
2.3 超聲提取法提取枸杞多糖
同上，在本部分實(shí)驗(yàn)中的枸杞子原料粉末也是為首先利用2.1.6中的最佳條件將枸杞色素提取出來后的烘干的料渣，故本部分試驗(yàn)是先提取枸杞色素后再進(jìn)行提取枸杞多糖。
2.3.1 不同超聲時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響
圖5 不同超聲時(shí)間對(duì)枸杞多糖得率的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic factors on the yield of Lycium barbarum polysaccharides
利用1.2.2.4的方法，考察不同超聲時(shí)間如10、20、30、40、50、60 min時(shí)對(duì)枸杞多糖得率的影響，料液比1∶10，20%超聲功率(最大功率1 200 W)下超聲2次，僅改變超聲時(shí)間，過濾，濾液于50～70 ℃濃縮，最后用95%乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得枸杞多糖粗粉。將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(A)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，超聲20 min時(shí)，提取的效果最佳。
2.3.2 不同超聲功率對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.4的方法，考察不同超聲功率如10%、15%、20%、25%、30%對(duì)枸杞多糖得率的影響，僅改變超聲功率，料液比1∶10，超聲2次，每次20 min，過濾，濾液于50～70 ℃濃縮，最后用95%乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得枸杞多糖粗粉。將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(B)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，超聲效率25%時(shí)，超聲提取多糖的效果最佳。
2.3.3 不同料液比對(duì)枸杞多糖得率的影響
利用1.2.2.4的方法，考察不同超聲料液比如1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30對(duì)枸杞多糖得率的影響，僅改變料液比，25%超聲功率下每次超聲2次，每次20 min，過濾，濾液于50～70 ℃濃縮，最后用95%乙醇沉淀，放置24 h，抽濾，所得固形物先后以95%乙醇、無水乙醇、丙酮依次洗滌、真空干燥(50 ℃)，即得枸杞多糖粗粉。將提取得到的粗多糖粉末，配制成0.10 mg/mL 的溶液，紫外檢測(cè)其中α-無水葡萄糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(C)所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，超聲料液比1∶10的條件下，超聲提取的效果最佳。
2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)
綜上所述，枸杞多糖以超聲水提時(shí)，超聲20 min，超聲功率25%，料液比為1∶10，多糖得率較高。因此，為了驗(yàn)證該條件的正確性，在此條件下進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，得其枸杞多糖的得率分別為5.35%，5.26%，5.08%，平均得率為5.23%。
2.4 枸杞多糖提取后枸杞色素的提取
由上可知，枸杞多糖的最佳提取條件為超聲水提，可能是枸杞色素由于枸杞子已經(jīng)過高溫提取而損失，但超聲又使枸杞子細(xì)胞進(jìn)一步的充分破碎，且超聲產(chǎn)生的熱量又促使枸杞多糖溶解，因此在此條件下，超聲水提法(5.23%)提取得到的枸杞多糖得率高于索氏水提(4.28%)。經(jīng)超聲水提未經(jīng)處理過的枸杞子，然后再利用枸杞色素提取的最佳條件進(jìn)行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此時(shí)枸杞多糖的平均得率為7.45%，而枸杞色素的平均得率為2.48%。
2.5 不同提取次序?qū)﹁坭缴睾丸坭蕉嗵强寡趸钚缘挠绊?/h3>
考察不同提取提取次序?qū)﹁坭缴睾丸坭蕉嗵强寡趸钚缘挠绊懀ㄟ^相同濃度下的枸杞色素、枸杞多糖和Vc對(duì)DPPH·和·OH的自由基清除率來確定，由于提取次序不同，不僅造成了先提取的枸杞色素和枸杞多糖分別比后提取的得率高，也會(huì)由于提取過程的影響對(duì)不同提取次序下的枸杞色素和枸杞多糖產(chǎn)生影響。具體結(jié)果如圖6所示：其中，枸杞色素1和枸杞多糖2分別代表先提枸杞色素然后再提的枸杞多糖，而枸杞色素2和枸杞多糖1則代表先提的枸杞多糖然后再提的枸杞色素。圖6表明，在同樣溶液濃度下，Vc對(duì)DPPH·和·OH的自由基清除率基本都是最大的，而枸杞色素和枸杞多糖則隨著濃度的升高，抗氧化活性逐漸增強(qiáng)，尤其是枸杞色素1在濃度升高到0.60 mg/mL及更高時(shí)，對(duì)DPPH·自由基的清除能力十分接近Vc。另外，圖6(A)和(B)均可發(fā)現(xiàn)，不同提取次序?qū)τ阼坭缴睾投嗵堑挠绊懖煌?，?duì)枸杞多糖的影響不大，但對(duì)枸杞色素的影響比較大，這可是能在先提取枸杞多糖時(shí)，所用溶劑把枸杞色素上的脂質(zhì)保護(hù)膜部分的破壞掉了，導(dǎo)致色素部分氧化造成的。同樣條件下，枸杞色素的抗氧化活性較枸杞多糖的強(qiáng)，所以枸杞色素受影響的情況較為明顯一點(diǎn)?？傮w上，枸杞色素1和枸杞多糖1對(duì)DPPH·自由基清除率都較高，枸杞多糖1對(duì)·OH自由基清除率都較高，其抗氧化活性接近Vc。
3 結(jié)論
綜上，在以正己烷為提取溶劑，提取2次，每次1 h，料液比1∶10，提取溫度為80 ℃時(shí)，可得到3.93%的枸杞色素，然后料渣通過超聲水提，在超聲20 min，超聲功率25%，料液比為1∶10的條件下可得到5.23%的枸杞多糖。改變提取順序，在同樣的提取條件下，可分別得到7.45%的枸杞多糖，2.48%的枸杞色素。因?yàn)殍坭蕉嗵鞘且环N易溶于熱水或稀酸、稀堿溶液，能被乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑析出的蛋白多糖，超聲提取法提取時(shí)，超聲波能夠破碎植物的細(xì)胞壁，從而可大幅度提高有效成分提取率。而枸杞色素則由于其本身性質(zhì)的不穩(wěn)定性，在先提取枸杞多糖時(shí)也會(huì)將枸杞色素部分的溶解出去，故后提取枸杞色素時(shí)其得率較低。同時(shí)，提取次序的改變對(duì)于枸杞色素和枸杞多糖的抗氧化活性都有一定的影響，但對(duì)枸杞色素的影響更大一點(diǎn)?？傮w上，枸杞色素1和枸杞多糖1對(duì)DPPH·自由基清除率都較高，枸杞多糖1對(duì)·OH自由基清除率都較高，其抗氧化活性接近Vc。在后續(xù)的研究中，將對(duì)多個(gè)提取條件的交互效應(yīng)以及提取次序的改變對(duì)其他成分的改變和影響進(jìn)行更多的深入研究。
圖6 枸杞色素、枸杞多糖及Vc的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of Lycium barbarum pigment,Lycium barbarum polysaccharide and Vc
猜你喜歡
化工設(shè)計(jì)(2022年4期)2023-01-02
電子測(cè)試(2022年16期)2022-10-17
石油煉制與化工(2022年2期)2022-02-15
環(huán)境衛(wèi)生工程(2021年3期)2021-07-21
環(huán)境科學(xué)研究(2021年5期)2021-05-20
環(huán)境衛(wèi)生工程(2021年1期)2021-03-19
環(huán)境衛(wèi)生工程(2021年1期)2021-03-19
化工管理(2021年31期)2021-01-09
汽車電器(2019年1期)2019-03-21
花火A(2018年9期)2018-11-26
