賀 倩,楊 萍,蔣雄武,洪鵬志,*,周春霞,陳康健

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心,廣東湛江 524088;2.廣東省水產(chǎn)品深加工及副產(chǎn)物高值化利用工程技術(shù)研究中心,湛江恒興水產(chǎn)科技有限公司,廣東湛江 510300)

我國(guó)是羅非魚(yú)養(yǎng)殖大國(guó),近十年來(lái)產(chǎn)量穩(wěn)居世界首位,2015年我國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)量達(dá)到177.95萬(wàn)噸[1]。我國(guó)羅非魚(yú)在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的銷售較少,出口的加工產(chǎn)品主要是凍羅非魚(yú)片和整條凍羅非魚(yú),產(chǎn)品單一、技術(shù)含量不高、附加值低。從2014年開(kāi)始,我國(guó)羅非魚(yú)出口量出現(xiàn)下滑趨勢(shì),產(chǎn)業(yè)出現(xiàn)停滯不前的狀態(tài)[1],尋找新的加工方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,已有報(bào)道魚(yú)蛋白通過(guò)酶解后可以制備多肽,這些多肽具有多種功能性[2]。研究結(jié)果證實(shí)羅非魚(yú)肉酶解液具有抗氧化[3-4]、降血壓[5-6]等生物活性。酶解法制備的魚(yú)蛋白酶解液有苦味重、雜質(zhì)多、顏色深等缺點(diǎn),是后續(xù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。

陶瓷膜具有機(jī)械強(qiáng)度大、耐磨性好、耐高溫、耐酸堿、耐有機(jī)溶劑、分離效率高、易清洗等優(yōu)點(diǎn),在食品領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛,在果汁的澄清[7]、乳蛋白濃縮[8]、酪蛋白與乳清蛋白的分離[9]、醬油除雜[10]等均有報(bào)道,但在水產(chǎn)加工方面的應(yīng)用報(bào)道不多。張曉瑜等[11]用200 nm陶瓷膜微濾處理馬氏珠母貝肉蛋白酶解液,發(fā)現(xiàn)陶瓷膜微濾可以改善酶解液的色值和澄清度,且使分子量小于5000 u的多肽在透過(guò)液中得到了富集。大孔樹(shù)脂具有多孔性和較大的比表面積,主要通過(guò)物理作用從溶液中有選擇性地吸附有機(jī)物質(zhì),從而達(dá)到分離純化的目的。另外,大孔樹(shù)脂具有化學(xué)穩(wěn)定性好,價(jià)格便宜,易于工業(yè)化等特點(diǎn)[12],因此大孔吸附樹(shù)脂分離技術(shù)現(xiàn)已大量用于環(huán)保、化工、醫(yī)藥和食品行業(yè)。本實(shí)驗(yàn)室前期采用大孔樹(shù)脂AB-8和DA20-C動(dòng)態(tài)吸附羅非魚(yú)下腳料蛋白酶解液[13],結(jié)果表明經(jīng)吸附處理后的羅非魚(yú)下腳料酶解液,腥味和苦味均變淡變小。

本文采用無(wú)機(jī)陶瓷膜微濾耦合大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附處理羅非魚(yú)肉酶解液,分析陶瓷膜處理和大孔樹(shù)脂吸附對(duì)酶解中多肽組分的影響,旨在為水產(chǎn)蛋白酶解肽的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考,為酶解羅非魚(yú)肉制備多肽的規(guī)?；a(chǎn)積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚(yú) 湛江恒興水產(chǎn)科技有限公司提供;中性蛋白酶(2×105U/g)、木瓜蛋白酶(6.5×105U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;陶瓷膜(材料Al2O3,平均孔徑50 nm,面積0.12 m2) 杭州沃騰膜工程有限公司;大孔吸附樹(shù)脂AB-8 南開(kāi)大學(xué)化工廠;分子量標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞色素C(12500 Da)、抑菌酶(6500 Da)、桿菌酶(1450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(189 Da) Sigma公司。

28L電加熱酶解罐 溫州東頂機(jī)械制造有限公司;WTM-CM-01陶瓷膜裝 杭州沃騰膜工程有限公司;FDU真空冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株式會(huì)社;S-433D全自動(dòng)氨基酸分析儀 德國(guó)Sykam;AKTA Purifier 100 美國(guó)GE醫(yī)療保健生物科學(xué)公司;Agilent 1200半制備高效液相 美國(guó)安捷倫科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅非魚(yú)酶解多肽的制備 取新鮮羅非魚(yú)肉均勻攪碎后,取4～5 kg放入酶解罐中,按料液比為1∶2.5 (m/v)的比例加入蒸餾水加熱,待物料達(dá)到50 ℃后,同時(shí)加入中性蛋白酶(500 U/g)和木瓜蛋白酶(425 U/g),酶解5 h后,升溫至100 ℃滅酶10 min,酶解液冷卻后,5000 r/min 離心15 min,取清液進(jìn)行50 nm陶瓷膜微濾(循環(huán)流量為20 L/min,跨膜壓力差為0.06 MPa),得透過(guò)液,混合均勻后取部分進(jìn)行AB-8大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附(上樣體積為7.5 BV,流速3 BV/h),之后用濃度為60%乙醇進(jìn)行洗脫(洗脫流速為3 BV/h)。各種處理得到的液體鋪成約為5 mm厚的薄層，再置于-40 ℃低溫下過(guò)夜后經(jīng)冷凍干燥成粉狀(凍干溫度為-58 ℃),酶解離心后的上清液多肽、經(jīng)過(guò)陶瓷膜微濾后的多肽、經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂處理流出的多肽、吸附在大孔樹(shù)脂上洗脫下來(lái)的多肽分別記為羅非魚(yú)肉酶解多肽(A)、陶瓷膜微濾多肽(B)、大孔樹(shù)脂流出多肽(C)、大孔樹(shù)脂洗脫多肽(D)。

1.2.2 基本成分測(cè)定 總氮的測(cè)定:參照GB 5009.5-2016食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定;灰分的測(cè)定:參照GB 5009.4-2016食品中灰分的測(cè)定;水分的測(cè)定:參照GB 5009.3-2010食品中水分的測(cè)定;脂肪的測(cè)定:索氏抽提法(GB/T 5009.6-2016)另外，拍照觀察各種多肽粉的顏色。

1.2.3 多肽分子量分布分析 采用AKTA Purifier 100分析酶解液的分子量分布。色譜柱:SuperdexTMPeptide 10/300 GL;流動(dòng)相:0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5,含0.15 mol/L NaCl),流速0.7 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分子量大小的對(duì)數(shù)與保留體積得到標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程為lgMw=-0.1874x+6.0058(R2=0.9826),樣品分子量分布根據(jù)保留體積與回歸方程求得。

1.2.4 氨基酸組成與含量分析 經(jīng)陶瓷膜和大孔樹(shù)脂處理、凍干后的樣品用6 mol/L HCl水解12 h后,50 mL容量瓶定容,取50 μL上柱分析,采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定氨基酸。

1.2.5 反相液相分析多肽極性 采用高效液相系統(tǒng)分析陶瓷膜微濾前后、AB-8大孔樹(shù)脂吸附流出和洗脫酶解液的極性。稱取0.100 g 1.2.1樣品,再加入2 mL超純水溶解,過(guò)0.22 μm微濾膜備用。色譜柱:XTerra R MS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:A超純水(0.05%三氟乙酸),B乙腈(100%),流速0.6 mL/min;檢測(cè)器:UV波長(zhǎng)220 nm;柱溫:25 ℃;上柱量:自動(dòng)進(jìn)樣10 μL。流動(dòng)相梯度:A:95%～40%;B:5%～60%;時(shí)間:30 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)羅非魚(yú)肉多肽基本成分的影響

由表1可知,B與A相比,蛋白質(zhì)含量差別不大,灰分減少了9.94%,脂肪增加了113.51%,可見(jiàn)陶瓷膜微濾對(duì)灰分有截留作用,且由于微濾過(guò)后酶解液蛋白質(zhì)含量變化不明顯，灰分含量有所減少,而陶瓷膜對(duì)脂肪沒(méi)有截留作用,所以B與A相比脂肪含量增加;C與B相比,蛋白質(zhì)含量降低了2.25%,灰分增加了25.17%,脂肪增加145.57%;D與B相比,蛋白質(zhì)含量降低了3.33%,灰分增加了44.59%,脂肪增加了167.09%。這可能是蛋白質(zhì)含量的降低,導(dǎo)致灰分與脂肪含量的相對(duì)升高?？梢?jiàn),50 nm陶瓷膜微濾處理羅非魚(yú)肉酶解液可以降低灰分含量,升高脂肪含量。經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附處理后,無(wú)論是流出液還是60%乙醇洗脫液灰分含量、脂肪含量均升高;綜上所述:陶瓷膜微濾和大孔樹(shù)脂吸附洗脫對(duì)酶解液蛋白質(zhì)含量影響不大,而陶瓷膜對(duì)灰分有一定的截留作用。如圖1,微濾多肽粉(B)比酶解多肽粉(A)澄清、顏色白,說(shuō)明陶瓷膜處理能起到除色作用。大孔樹(shù)脂吸附后的多肽粉(C)比酶解多肽粉(A)顏色白,而洗脫多肽粉(D)略呈黃色,可見(jiàn)大孔樹(shù)脂吸附也能起到脫色的效果。

表1 處理前后多肽的基本成分(干基計(jì),%)Table 1 Basic ingredients of hydrolysis peptides before and after refining(dry basis,%)

圖1 精制前后多肽粉的色澤變化

2.2 對(duì)羅非魚(yú)肉多肽分子量分布的影響

酶解多肽、微濾多肽、大孔樹(shù)脂吸附流出多肽及洗脫多肽的HPSEC圖見(jiàn)圖2,分子量分布如表2。由表2可知,四種多肽主要由5 ku以下的肽段組成。微濾處理后,酶解多肽中除了<1 ku組分比例增加了4.25%外,1～2、2～3、3～5、5～8 ku組分的比例分別減少了7.29%、17.13%、33.93%和50.0%,說(shuō)明50 nm微濾處理對(duì)多肽有截留作用,分子量越大,截留比例越大;與微濾多肽相比，AB-8大孔樹(shù)脂處理后,流出多肽中除了1～2、2～3 ku組分的比例分別增加了9.42%與2.51%外,其余組分的占比均下降；而洗脫多肽中,除了<1 ku組分比例減少了6.01%外,1～2、2～3、3～5、5～8 ku組分的比例分別增加了0.96%、62.01%、81.45%、200%,可見(jiàn)AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)2～8 ku多肽的吸附較敏感。宋雪梅[14]利用凝膠色譜Sephadex G-25分離干酪中的苦味肽，結(jié)果表明所有苦味肽組分的分子量在189～5000 u之間。Ney[15]發(fā)現(xiàn),分子量大于6 ku的多肽沒(méi)有苦味,蔣雄武等[13]發(fā)現(xiàn)用大孔樹(shù)脂吸附羅非魚(yú)下腳料蛋白酶解液后,分子量在1～5 ku范圍內(nèi)的短肽含量的降低可能與酶解液的苦味改善有很大關(guān)系。劉伯業(yè)[16]研究認(rèn)為，如不考慮其它因素對(duì)苦味肽苦味閾值的影響,分子量處于0.5～3 ku區(qū)間的多肽比分子量處于0.18～0.5 ku區(qū)間的小肽含有更高比例的強(qiáng)苦味肽,解銘等[17]發(fā)現(xiàn)鱈魚(yú)肉酶解多肽苦味成分主要集中在分子量3～6 ku的多肽中,3 ku以下的多肽也有較明顯的苦味,由此,推測(cè)洗脫多肽中富集了苦味肽。

表2 處理前后多肽的分子量分布(%)Table 2 HPSEC chromatogram of hydrolysis peptides before and after refining(%)

圖2 處理前后多肽的分子量分布圖(HPSEC圖)

2.3 對(duì)酶解多肽氨基酸組成與含量的影響

表3分析了處理前后的羅非魚(yú)肉蛋白酶解多肽中16種游離氨基酸含量(色氨酸沒(méi)檢測(cè))。與A相比,B的游離氨基酸總量減少3.96%,C的總量增大了19.06%,D的總量減少65.83%;A中必需氨基酸占總游離氨基酸的52.19%,B、C和D中則分別各占57.40%、53.33%和55.36%;說(shuō)明微濾、吸附以及洗脫均提高了游離氨基酸中必需氨基酸的比例。

表3 處理前后酶解多肽的游離氨基酸含量(干基計(jì),%)Table 3 Contents of free amino acids in components hydrolysis peptides before and after refining(dry basis,%)

由表4可知,與A比較,B、C、D的氨基酸總量分別減少了1.09%、2.02%和1.94%,四種多肽中必需氨基酸分別占氨基酸總量的41.15%、40.70%、38.98%和45.18%,苦味氨基酸分別占氨基酸總量的26.65%、26.12%、23.10%和34.53%,疏水性氨基酸分別占氨基酸總量的40.67%、39.93%、36.90%和53.35%。與B比較，C的氨基酸總量降低0.94%，必需氨基酸含量降低5.13%，苦味氨基酸與疏水性氨基酸含量分別降低12.35%和8.44%。可見(jiàn),陶瓷膜微濾對(duì)酶解多肽的氨基酸組成影響不大;大孔樹(shù)脂吸附使酶解多肽氨基酸總量、必需氨基酸、苦味氨基酸與疏水性氨基酸含量降低;大孔樹(shù)脂洗脫則使酶解多肽必需氨基酸、苦味肽與疏水性氨基酸含量提高。這也與魏芳等[18]用大孔樹(shù)脂分離阿膠低聚肽,測(cè)得分離后的阿膠低聚肽疏水性氨基酸含量比分離前低的結(jié)果相一致。

表4 處理前后酶解多肽的總氨基酸含量(干基計(jì),%)Table 4 Contents of total amino acidss in components hydrolysis peptides before and after refining(dry basis,%)

從單個(gè)的氨基酸來(lái)分析,與酶解多肽相比,流出多肽中苯丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸分別增加了107.00%、83.97%和32.63%,大孔樹(shù)脂比較易于吸附苯丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸;且其對(duì)異亮氨酸、亮氨酸和蛋氨酸也有較強(qiáng)吸附作用,即吸附較多的苦味氨基酸。這與趙謀明等[19]研究發(fā)現(xiàn)大孔樹(shù)脂對(duì)氨基酸的吸附具有一定的選擇性的結(jié)論相一致。同時(shí),表4中C的前6種氨基酸含量與A、B、D相對(duì)偏高,可能是由于氨基酸受自身極性及其他因素的影響,不同的氨基酸被大孔樹(shù)脂吸附的量有所不同,而組分中總氨基酸含量的減少導(dǎo)致個(gè)別氨基酸含量的變動(dòng)。

比較A、B、C、D四種多肽的游離氨基酸與總氨基酸總量,可得四種多肽中游離氨基酸的比例分別有8.18%、7.95%、9.94%、2.85%,說(shuō)明大孔樹(shù)脂對(duì)肽的吸附能力較強(qiáng),游離氨基酸吸附較少。

綜上所得,從游離氨基酸結(jié)果看,陶瓷膜微濾處理除了富集賴氨酸以外,對(duì)酶解多肽的氨基酸組成影響不大;大孔樹(shù)脂對(duì)肽的吸附能力較強(qiáng),游離氨基酸吸附較少;大孔樹(shù)脂對(duì)苦味氨基酸和疏水性氨基酸有較強(qiáng)吸附作用,進(jìn)一步推測(cè)出大孔樹(shù)脂吸附處理后的洗脫組分可能富集了苦味肽。

2.4 處理前后酶解多肽的反相液相分析

苦味肽一般由幾個(gè)帶有疏水側(cè)鏈的氨基酸組成,這些疏水性基團(tuán)通常隱藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部,通過(guò)酶解暴露出來(lái)后與苦味受體相互作用進(jìn)而產(chǎn)生苦味[20]。反相液相(RP-HPLC)固相載體有疏水性,它可以根據(jù)被分離物質(zhì)分子疏水性的不同而在反相柱中彼此分離,由此疏水性較弱的分子較快流出,疏水性相對(duì)較強(qiáng)的分子在柱內(nèi)保留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),出峰時(shí)間晚些。研究認(rèn)為苦味肽的苦味強(qiáng)度與疏水性氨基酸含量有關(guān)[14],Cliffe等[21]證實(shí)在RPLC上保留時(shí)間短的是無(wú)苦味、低分子量的親水性肽與氨基酸,保留時(shí)間長(zhǎng)的是苦味、大分子量的疏水性肽。Wang等[22]用HILICL-RPLC分離系統(tǒng)分離親水性溶質(zhì)與疏水性溶質(zhì),結(jié)果表明C18柱對(duì)親水性溶質(zhì)的保留效果較弱。Newman等[23]利用RP-HPLC和感官評(píng)定分析巴氏殺菌奶酪,結(jié)果發(fā)現(xiàn)疏水性多肽含量與苦味值成正相關(guān)。采用RP-HPLC分析的酶解多肽粉、微濾多肽粉、吸附多肽粉與洗脫多肽粉結(jié)果如圖3。

圖3 處理前后酶解多肽的反相色譜圖

比較圖3a和圖3b可知,微濾多肽中保留時(shí)間在10 min前的組分含量減少,10 min后的組分相差不大,這與氨基酸結(jié)果中微濾多肽的游離氨基酸含量減少一致;比較圖3b和圖3c可知,流出多肽中保留時(shí)間在10 min前的組分含量增加,10 min后的組分含量減少,這也與氨基酸結(jié)果中流出多肽的游離氨基酸含量增加一致,同時(shí)表明AB-8大孔樹(shù)脂主要吸附極性弱、疏水性強(qiáng)肽;比較圖3b和圖3d可知,洗脫多肽中保留時(shí)間在15 min前的組分含量大幅減少,這也與氨基酸結(jié)果中洗脫多肽的游離氨基酸含量大幅減少一致。根據(jù)反相色譜的原理,出峰時(shí)間是由溶質(zhì)的親水性和疏水性決定的,比較圖3a～圖3d,可知洗脫多肽中疏水性肽段較多,推測(cè)洗脫多肽中含有較多的苦味肽段,表明大孔樹(shù)脂能吸附苦味肽。

3 結(jié)論

陶瓷膜微濾處理對(duì)羅非魚(yú)肉酶解多肽的灰分有截留作用,對(duì)酶解多肽的其他基本成分含量基本無(wú)影響;與酶解多肽相比，大孔樹(shù)脂AB-8吸附和洗脫處理后,蛋白損失率分別為1.99%和3.07%,灰分和脂肪含量都有所增加。陶瓷膜微濾和大孔樹(shù)脂吸附都起到脫色效果。

陶瓷膜微濾對(duì)酶解多肽粉的分子量分布影響不大。與微濾多肽相比，AB-8吸附多肽中,除了1～2、2～3 ku組分的比例增加外,其余組分的占比均下降；而洗脫多肽中,除了<1 ku組分比例減少外,1～2、2～3、3～5、5～8 ku組分的比例均增加,可見(jiàn)AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)2～8 ku多肽的吸附較敏感。

陶瓷膜微濾處理除了富集賴氨酸以外,對(duì)酶解多肽的氨基酸組成影響不大;AB-8吸附使氨基酸總量、必需氨基酸、苦味氨基酸與疏水性氨基酸含量降低,對(duì)肽的吸附能力較強(qiáng),對(duì)游離氨基酸吸附較少。

反相液相分析結(jié)果顯示,洗脫多肽粉比酶解多肽粉、微濾多肽粉與吸附多肽粉含有更多的疏水性肽段,即大孔樹(shù)脂可以吸附苦味肽改善羅非魚(yú)肉酶解液的風(fēng)味。