程洪杰，李巖*，孫鐵峰

(1.山東省新泰市中醫(yī)醫(yī)院，山東 泰安 271200；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014)

白色念珠菌是一種機會致病真菌，臨床上誘發(fā)的感染性疾病主要由機體正常菌群失調，導致其在機體內大量繁殖而引起。隨著唑類、多烯類抗真菌藥物的廣泛應用，使耐藥菌株產生率不斷上升[1-2]。大量研究表明中國傳統(tǒng)醫(yī)學中的中藥及復方制劑在抗真菌方面療效確切、安全性好、耐藥率低[3]，而目前對中藥類制劑抗真菌研究主要集中在復方對真菌類疾病的臨床療效研究、復方中單味藥及其提取成分對真菌抑菌活性和機理研究[4-7]。以復方協(xié)同增效的觀點，對中醫(yī)組方原則下的君、臣、佐、使進行評價的實驗研究尚不多見。

本實驗中復方苦參洗劑(魯藥制字Z09080016)由苦參、地膚子、黃柏等8味中藥復方組成，是我院研制用于治療念珠菌等真菌感染的中藥復方制劑，臨床上應用于治療女性陰道炎、外陰瘙癢、濕疹和癬等疾病并取得良好療效。該制劑體現(xiàn)了清熱解毒、燥濕止癢的中醫(yī)組方原則，文獻表明方中各藥味均具有一定的抑菌活性，按照中醫(yī)原則組方后，其表現(xiàn)出復方抑菌效果的增強。但是否與方中君、臣、佐、使藥組的協(xié)同增效有關，尚待進一步研究。本實驗以臨床主治的白色念珠菌為代表，通過體外對白色念珠菌的抑菌效果，以上述問題為導向，對該制劑的復方抑菌增效作用進行評價研究，為該制劑的復方抑菌增效機理提供理論支撐，也為制劑的工藝優(yōu)化提供新思路。

1 材料

1.1 菌株與藥材

菌株：由山東省臨床檢驗中心提供，實驗標準菌株為白色念珠菌(C.albicans, ATCC10231)。

中藥材：黃柏Phellodendri Chinensis Cortex、蒲公英Taraxaci Herba、苦參Sophorae Flavescentis Radix、蛇床子Cnidii Fructus、地膚子Kochiae Fructus、花椒Zanthoxyli Fericarpium、白礬Alumen、白鮮皮Dictamni Cortex購自上海雷允上中藥飲片廠，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒定為真品，且與實驗中復方苦參洗劑制劑中使用的中藥材同批次，粉碎過100目篩備用。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

RPMI1640培養(yǎng)液(無抗生素型)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud Dextrose Agar，SDA)、沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(Sabouraud Dextrose Broth，SDB)均購自上海一基實業(yè)有限公司；二甲亞砜(Solarbio公司)。

PBS緩沖液：稱取Na2HPO42.9 g、KH2PO40.2 g、NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g，加無菌純水至1000 mL，溶解，過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

MTT染液：稱取MTT(北京索萊寶科技有限公司)粉末0.5 g溶于100 mL PBS溶液中，避光攪拌溶解，過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 儀器

CP114電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)； STIKCO2恒溫培養(yǎng)箱(上海施都凱儀設備有限公司)；生物安全柜(蘇凈安泰超凈工作臺公司)；xMark酶標儀(美國BIO-RAD公司)；ZWY-211C恒溫搖床振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；BXM-75VD立式高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司)；Allegra X-30R高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 供試藥液的制備

單味藥組水提液的制備：按照處方組成及復方制備方法，取苦參6.0 g、蒲公英6.0 g、黃柏3.0 g、地膚子3.0 g，白礬2.0 g、花椒2.0 g，蛇床子4.0 g、白鮮皮2.4 g分別單獨置于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL水，稱定重量，回流提取3 h后補足重量，分取各單味中藥續(xù)濾液20 mL用于后續(xù)實驗，最終各單藥組濃度相當于復方組中各生藥濃度，分別為苦參0.060 g/mL、蒲公英0.060 g/mL、黃柏0.030 g/mL、地膚子0.030 g/mL、白礬0.020 g/mL、花椒0.020 g/mL、蛇床子0.040 g/mL、白鮮皮0.024 g/mL。121 ℃高壓流通蒸汽滅菌25 min后置于4 ℃冰箱備用。

復方組水提液的制備：按處方組成全部藥味一起提取，制備方法同上(批號20180706)，最終制得藥液濃度相當于生藥濃度為0.284 g/mL，取續(xù)濾液20 mL用于后續(xù)實驗，121 ℃高壓流通蒸汽滅菌25 min后置于4 ℃冰箱備用。

君藥組水提液的制備：取處方中君藥組成苦參6.0 g、黃柏3.0 g、花椒2.0 g、白礬2.0 g，制備及后續(xù)保存?zhèn)溆梅椒ㄍ?，最終制得藥液濃度相當于生藥濃度為0.130 g/mL。

臣藥組水提液的制備：取處方中臣藥組成蒲公英6.0 g、白鮮皮2.4 g，制備及后續(xù)保存?zhèn)溆梅椒ㄍ?，最終制得藥液濃度相當于生藥濃度為0.084 g/mL。

佐藥組水提液的制備：取處方中佐藥地膚子3.0 g、蛇床子4.0 g一起置于250 mL圓底燒瓶中，制備及后續(xù)保存?zhèn)溆梅椒ㄍ?，最終制得藥液濃度相當于生藥濃度為0.070 g/mL。

2.2 供試菌液的制備

(1)菌種活化：在無菌條件下用劃線法將冷凍保存在沙氏斜面培養(yǎng)基的標準菌株接入SDA上，37 ℃培養(yǎng)48 h進行活化。

(2)供試菌液制備：將上述菌種用標準接種環(huán)挑選單株典型新鮮菌落接入已滅菌的SDB中，37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，取出純化培養(yǎng)的菌種無菌低溫離心(3000 r/min )3 min，棄去上清液，用0.9%無菌生理鹽水洗脫菌落制成菌懸液，經(jīng)牛鮑氏計數(shù)板計數(shù)法調整其菌含量為1×106～5×106cfu ·mL-1，接種時再用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋1000倍為1×103～5×103cfu ·mL-1備用。

2.3 體外抑菌實驗

單味中藥組：取96孔細菌培養(yǎng)板，自第1行的第1～8孔分別加100 μL RPMI1640培養(yǎng)液，每行第1孔加200 μL供試中藥水提液，第2孔加100 μL供試中藥水提液，混勻后，自第2孔吸取100 μL混合液加入第3孔混勻，依次向下一孔吸取、混勻，作倍比稀釋，至第8孔混勻后，吸取100 μL棄去，吸取2.2項下備用菌液100 μL接種至對應的96孔細胞培養(yǎng)板的第1～8孔中混勻，即制得濃度為原提取液濃度1/2～1/256的系列含藥培養(yǎng)液，第9孔為陰性對照(加入100 μL 稀釋為原濃度1/2的RPMI1640培養(yǎng)液及100 μL備用菌液)，第10孔為空白對照(加入10 μL MTT、100 μL DMSO)。本實驗8種中藥，每種單藥采用上述方法倍比稀釋為8個濃度梯度，各做3行復孔，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

復方組：精密吸取1 mL藥物原液，加入無菌試管，以同體積RPMI1640培養(yǎng)液稀釋混勻，得到濃度為原液濃度1/2的藥液，同樣方法再操作2次得到濃度為原液濃度1/8的藥液備用。取96孔細菌培養(yǎng)板，自第1行的第1～5孔分別加100 μL RPMI1640培養(yǎng)基，每行第1 孔加100 μL上述1/8濃度供試中藥水提液，混勻。自第1孔吸取100 μL混合液加入第2孔，依次作倍比稀釋，至第5孔混合后，吸取100 μL棄去，吸取2.2項下備用菌液100 μL接種至對應的96孔細菌培養(yǎng)板第1～5孔中混勻，即制得濃度為原提取液濃度1/32～1/512的系列含藥培養(yǎng)液，第6孔為陰性對照，第7孔為空白對照，同時做3行復孔，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

君、臣、佐各藥組：稀釋處理方法同單味中藥組，最終制得濃度為原提取液濃度1/2～1/256的系列含藥培養(yǎng)液，第9孔為陰性對照，第10孔為空白對照，同時做3行復孔。吸取2.2項下備用菌液100 μL接種至對應的96孔細菌培養(yǎng)板第1～8孔中混勻，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

C′=C0×f，

其中，C′為每孔最終稀釋濃度，C0為原藥液濃度，f為稀釋分數(shù)。

MTT法判定ρMIC終點：兩組于培養(yǎng)結束前4 h，每孔加入10 μL MTT染液后，繼續(xù)培養(yǎng)至結束，加入100 μL二甲亞砜于搖床震搖20 min，無菌低溫離心(3000 r /min )10 min，轉移顯色上清液于另一孔板，并做好標記，使用酶標儀測吸光度A570 nm，并計算抑菌率，以抑菌率大于等于80%孔的藥液濃度作為ρMIC判定終點，實驗重復3 次，以3次相同的ρMIC終點為報告依據(jù)。

抑菌率 = (A陰性對照-A實驗組) /(A陰性對照-A空白對照)×100%。

2.4 體外聯(lián)合抑菌實驗

采用聯(lián)合抑菌指數(shù)(IFIC)判定兩藥聯(lián)合的作用結果。協(xié)同作用：IFIC≤0. 5；相加作用：0. 52 。

IFIC=(A*/A′)+(B*/B′) ，

其中A*為聯(lián)用時A藥組ρMIC，A′為單用時A藥組ρMIC，B*為聯(lián)用時B藥組ρMIC，B′為單用時B藥組ρMIC。

3 結果

3.1 單藥組和復方組對白色念珠菌的體外抑菌活性結果

8味中藥水提液及復方苦參組對白色念珠菌的體外抑菌結果見表1。由結果可知8味中藥的ρMIC范圍為7.50 ～30.00 mg/mL，其中黃柏、苦參、花椒、白礬4味君藥的ρMIC范圍為5.00～7.50 mg/mL；君、臣、佐各藥組的ρMIC范圍為4.01 ～21.00 mg/mL；復方組的ρMIC為2.22 mg/mL。

表1 各藥組對白色念珠菌的體外抑菌活性

3.2 體外聯(lián)合抑菌實驗結果

4味君藥以及君、臣、佐3個藥組間進行體外聯(lián)合抑菌實驗，結果見表2、3。通過4味君藥聯(lián)合抑菌IFIC發(fā)現(xiàn)：黃柏+苦參、黃柏+白礬、花椒+白礬3組的IFIC≤0.5，作用性質為協(xié)同抑菌作用；黃柏+花椒、苦參+花椒、苦參+白礬3組的0.5

表2 黃柏等4味君藥聯(lián)合體外抑菌作用性質

表3 君、臣、佐藥組聯(lián)合體外抑菌作用性質

4 討論

復方苦參洗劑處方系由清代《瘍科心得集》中苦參湯化裁而來，方中苦參、黃柏、明礬大苦大寒，具有清熱燥濕，解毒療瘡，殺蟲止癢之功，花椒性辛散、溫通，亦具止痛、止癢之功，4味藥苦寒燥濕為主，辛溫制寒濕為輔，共為方中君藥；蒲公英、白鮮皮苦寒之性稍遜，以祛風燥濕，消腫散結之力輔助君藥，為方中臣藥；蛇床子、地膚子寒中有溫，溫而制寒，以溫陽利濕之功為方中佐藥，8藥相合共奏清熱解毒、燥濕止癢之功。研究表明方中8味中藥都有特定抑菌機制，其中苦參中苦參堿具有抑制白色念珠菌細胞膜成分麥角固醇合成的作用，抑制其大量繁殖；黃柏中小檗堿可致白色念珠菌分裂周期異常而出現(xiàn)遺傳物質丟失；地膚子甲醇萃取液可降低病菌體內酶活性[8-9]；蛇床子醇提液能降低真菌Hsp60和Hsp90的表達，抑制其增殖；白鮮皮提取物可降低白色念珠菌的ALS3、HWP1等相關基因的表達，花椒中揮發(fā)油、蒲公英中綠原酸都可破壞細菌細胞膜，白礬溶液可滲入菌體使內部蛋白變性，而起到抑菌作用[10-13]。

本實驗發(fā)現(xiàn)復方中8味中藥水提液對白色念珠菌均有一定的抑菌效果，其中花椒、白礬、苦參、黃柏4味君藥對白色念珠菌抑菌效果較好，君藥組的抑菌活性強于各單藥組、臣藥組和佐藥組，復方組的抑菌效果最好；通過4味君藥進行體外聯(lián)合抑菌實驗發(fā)現(xiàn)黃柏+苦參、黃柏+白礬、花椒+白礬的聯(lián)合抑菌作用性質為協(xié)同抑菌，黃柏+花椒、苦參+花椒、苦參+白礬的聯(lián)合抑菌作用性質為相加抑菌；通過君、臣、佐3個藥組間聯(lián)合抑菌實驗發(fā)現(xiàn)君藥組+臣藥組的聯(lián)合抑菌作用性質為協(xié)同抑菌，君藥組+佐藥組、臣藥組+佐藥組的聯(lián)合抑菌作用性質為相加抑菌。綜上所述，復方組的聯(lián)合抑菌效果明顯強于單藥組和君、臣、佐3個藥組的抑菌效果，從4味君藥聯(lián)合抑菌結果分析，黃柏與苦參、白礬以及花椒與白礬的協(xié)同抑菌作用，苦參與花椒、白礬以及黃柏與花椒的相加抑菌作用都參與了君藥組聯(lián)合抑菌效果的增強，黃柏、苦參、花椒、白礬4味君藥在復方整體的抑菌效果中作用較大，這體現(xiàn)了中醫(yī)組方君藥發(fā)揮主要治療作用的原則。君、臣、佐各藥組以抑菌效果由大到小排序為君藥組、佐藥組、臣藥組，其中君藥組+臣藥組的協(xié)同抑菌作用體現(xiàn)了中醫(yī)組方臣藥輔助君藥加強治療作用的原則，而君藥組+佐藥組、臣藥組+佐藥組的相加抑菌作用體現(xiàn)了中醫(yī)組方佐助藥協(xié)助君、臣藥加強治療作用的原則。通過上述各藥組協(xié)同和相加抑菌作用相互配合，使得復方苦參洗劑表現(xiàn)出更強的抑菌效果。

該中藥復方在遣藥組方時既遵循中醫(yī)藥理論原則，又符合現(xiàn)代多效、聯(lián)合、協(xié)同的抑菌藥物應用規(guī)律，本實驗中復方苦參洗劑所含8味中藥均具有不同的抑菌活性，通過對具有不同抑菌譜和抑菌機制的中藥復方運用，提高了制劑的抑菌效果，作為傳統(tǒng)制劑，還可根據(jù)本實驗中復方抑菌協(xié)同增效作用的相關研究，優(yōu)化黃柏、苦參、花椒、白礬4味君藥的制備工藝，適當調整君藥組、臣藥組和佐藥組的投料配比，使其更好地發(fā)揮中藥抗菌作用。