朱霞，張亮，2，印曉星，劉耀武

(1徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實驗室，江蘇徐州221004;2鶴壁市人民醫(yī)院)

糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能障礙是近年來研究較多的糖尿病并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)能力障礙、思維記憶能力下降，病程進(jìn)展到后期患者會出現(xiàn)生活不能自理，嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量［1］。雖然，糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂是重要原因之一。大量研究表明，糖尿病動物表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知功能損害，伴有大腦皮層和海馬等部位的乙酰膽堿酯酶(AchE)表達(dá)增加［2～4］，AchE抑制劑能夠改善糖尿病認(rèn)知功能障礙［5，6］。在糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制中，脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)損害扮演著極其重要的角色。其中，丙二醛(MDA)水平是體內(nèi)氧化應(yīng)激活躍程度的標(biāo)志物。在腦的學(xué)習(xí)和記憶功能中，特別是腦的長期記憶功能中，蛋白質(zhì)翻譯過程和新蛋白質(zhì)合成起到至關(guān)重要的作用。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作為PI3K/Akt通路下游重要的效應(yīng)蛋白［7］，不僅調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯，還參與蛋白質(zhì)降解、核糖體合成等生理過程，而且與衰老、腫瘤、糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生也關(guān)系密切。例如:活化的mTORC1可磷酸化其下游蛋白70 kD核糖體S6蛋白激酶(p70S6K)，促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖等［8］。那么，糖尿病狀態(tài)下，腦內(nèi)mTOR信號是否過度激活并參與了AchE合成的調(diào)控，mTOR通路對AchE蛋白合成的調(diào)控是否與PI3K/Akt通路有關(guān)，尚未可知。2017年9月～2018 年3月，我們觀察了自發(fā)性2型糖尿病模型動物db/db小鼠腦組織中mTOR信號和AchE蛋白表達(dá)的變化，以及PI3K抑制劑LY294002對其的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 12周齡2型糖尿病模型動物C57BL/KSJ db/db小鼠及同周齡非糖尿病動物C57/KSJ db/m小鼠，由南京軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供。試劑:PI3K抑制劑LY294002(美國Sigma公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(杭州碧云天生物技術(shù)研究所)，葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)，AchE檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);二硝基苯肼(上海阿拉丁試劑有限公司)，氯化四乙銨(上海源葉生物科技有限公司);mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR，Ser2448)和磷酸化p70S6K(p-p70S6K，Thr389)抗體(美國Cell Signaling公司)，p70S6K抗體(英國Abcam公司)，AchE抗體(美國Bioworld公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與干預(yù)處理 將16只db/db小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為抑制組和模型組各8只，分別腹腔注射溶于5% DMSO中的LY294002 3 mg/kg和相同體積的5% DMSO溶液。將6只同周齡db/m小鼠作為正常對照組，腹腔注射相同體積的生理鹽水。各組小鼠連續(xù)給藥7 d，摘除眼球采血，收集血液，分離血清;處死，剝?nèi)〈竽X皮質(zhì)，置于－70℃冰箱保存。

1.2.2 血糖和血清MDA檢測 采用Elx808IU酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，以氧化酶法檢測葡萄糖。采用HPLC-UV法檢測血清MDA，按照文獻(xiàn)［9］的方法進(jìn)行:依據(jù)樣本中MDA和衍生化試劑二硝基苯肼反應(yīng)，生成的產(chǎn)物在310 nm波長處有最大紫外吸收的特點(diǎn)進(jìn)行測定;MDA標(biāo)準(zhǔn)溶液是通過已知濃度的氯化四乙銨貯備液的酸水解而獲得，然后按比例稀釋得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 大腦皮質(zhì)中AchE活性檢測 采用酶底物法。取大腦皮質(zhì)，用生理鹽水制備成10%的勻漿，離心取上清液。BCA法測定總蛋白濃度，按照試劑盒操作步驟測定AchE。

1.2.4 大腦皮質(zhì)中AchE、mTOR和p70S6K磷酸化水平測定 采用Western blotting法。取大腦皮質(zhì)，用全細(xì)胞裂解液進(jìn)行超聲破碎，離心取上清液。BCA法測定樣本蛋白濃度后，各組用裂解液配平，加上樣緩沖液，沸水變性。將40 μg蛋白在SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)上樣電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。封閉后加一抗，4℃孵育過夜;室溫下PBS洗去一抗，加入二抗室溫孵育2 h。室溫下PBS洗去二抗，用圖像處理儀(Gene Company)軟件分析圖像，Image J分析軟件進(jìn)行灰度分析。以GAPDH為內(nèi)參，分別以p-mTOR灰度值/T-mTOR灰度值、p-p70S6K灰度值/T-p70S6K灰度值表示mTOR和p70S6K磷酸化水平。以AchE與GAPDH灰度比值表示AchE相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以珋x±s表示，兩組間比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血糖、血清MDA水平比較 與正常對照組比較，模型組血糖和血清MDA水平均增高(P均＜0.01);與模型組比較，抑制組血清MDA水平降低(P＜0.05)，而血糖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組血糖和血清MDA水平比較(珔x±s)

＊＊正常對照組6 8.18±1.44 2.391±0.124

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 各組大腦皮質(zhì)中AchE活性和表達(dá)水平比較模型組大腦皮質(zhì)中AchE活性和表達(dá)量分別為(1.654±0.104)U/mg protein、0.957±0.089，高于正常對照組的(1.334±0.143)U/mg protein、0.508 ±0.222(P＜0.05或＜0.01);抑制組大腦皮質(zhì)中AchE表達(dá)量(0.506±0.161)低于模型組(P＜0.05)，而與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義;抑制組大腦皮質(zhì)中AchE活性為(1.473±0.091)U/mg protein，較模型組沒有明顯降低。

2.3 各組大腦皮質(zhì)中mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平比較 與正常對照組比較，模型組大腦皮質(zhì)中mTOR和p70S6K磷酸化水平均增加(P均＜0.05);與模型組比較，抑制組大腦皮質(zhì)中mTOR和p70S6K磷酸化水平降低(P＜0.05或＜0.01)。見表2。

表2 各組大腦皮質(zhì)中mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平比較(珔x±s)

*正常對照組8 0.917±0.141 0.790±0.132

注:與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，##P＜0.01。

3 討論

糖尿病患者往往存在學(xué)習(xí)、記憶能力等方面的認(rèn)知功能障礙，而中老年人群中即使合并輕度認(rèn)知功能障礙，遠(yuǎn)期老年癡呆發(fā)生率亦可達(dá)30%～40%［10］。研究表明，氧自由基代謝和膽堿酯酶水平異常在輕度認(rèn)知功能障礙發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［11］。本研究結(jié)果顯示，在自發(fā)性2型糖尿病小鼠腦內(nèi)AchE表達(dá)增加，同時伴有腦內(nèi)的mTOR/p70S6K通路激活;PI3K抑制劑LY294002可抑制mTOR通路激活，降低AchE表達(dá)。這表明在2型糖尿病狀態(tài)下腦內(nèi)AchE表達(dá)上調(diào)，而PI3K/Akt/mTOR通路激活可能介導(dǎo)了這一作用。該發(fā)現(xiàn)為糖尿病認(rèn)知功能障礙的防治提供了新思路。

在高糖條件下，氧化應(yīng)激增加引起海馬組織結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙［12，13］。糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙時，AchE表達(dá)增加，伴隨著體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增加，如腦內(nèi)抗氧化系統(tǒng)減弱及脂質(zhì)過氧化水平增加［2～4，14］。另外，抗氧化劑可顯著降低AchE表達(dá)從而改善糖尿病認(rèn)知功能障礙［4，14，15］。Dabidi等［16］發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激造成腦組織損傷，隨著病程的進(jìn)展，腦損傷逐漸積累，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性甚至壞死，進(jìn)而發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性不可逆性損傷，導(dǎo)致糖尿病認(rèn)知障礙的發(fā)生。MDA是腦組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，特別是腦組織損傷時，大量氧自由基可以使脂質(zhì)過氧化，所以MDA水平可以提示糖尿病時氧化應(yīng)激活躍程度。本研究結(jié)果顯示，模型組血清MDA水平較正常對照組增加，表明氧化應(yīng)激在糖尿病認(rèn)知功能障礙發(fā)生發(fā)展中有重要作用;而抑制組給予PI3K抑制劑LY294002后可以降低血清MDA水平，提示PI3K抑制劑能減少腦內(nèi)氧化應(yīng)激的損傷程度。

乙酰膽堿廣泛參與到機(jī)體的高級神經(jīng)功能活動中，而作為其水解酶，AchE具有調(diào)節(jié)神經(jīng)功能、改善大腦思維及記憶等多方面的作用。許多研究已表明，糖尿病認(rèn)識功能障礙的發(fā)生與腦內(nèi)AchE功能障礙有關(guān)，AchE活性上升可引起認(rèn)知功能下降，且絕大部分輕度認(rèn)知功能障礙患者合并膽堿能神經(jīng)功能下降［2～6］。本研究結(jié)果表明，在自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠腦內(nèi)AchE表達(dá)增加，伴有血中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平增加。這說明糖尿病狀態(tài)下氧化應(yīng)激可能有助于AchE的損害，這與文獻(xiàn)［3，4］的報道相一致。

PI3K是生長因子受體超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要激酶，PI3K磷酸化后激活A(yù)kt進(jìn)而參與眾多生物學(xué)過程的調(diào)控。mTOR屬于磷脂酰肌醇相關(guān)激酶家族成員，是PI3K/Akt通路下游的重要效應(yīng)蛋白。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，介導(dǎo)多種細(xì)胞信號傳遞并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、自噬及核糖體合成等過程，在細(xì)胞生長和增殖分化等方面起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯，而且與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生有密切關(guān)系［8］。作為一種功能廣泛的大分子蛋白質(zhì)，mTOR可在多個位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，如Ser1261、Thr2446及Ser2448等，磷酸化的mTOR可進(jìn)一步激活下游靶分子進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞活動。其中，Ser2448磷酸化是mTOR接受上游Akt信號的主要位點(diǎn)［17］。p70S6K是mTOR最重要的下游位點(diǎn)之一。在高糖條件下，細(xì)胞內(nèi)mTOR被磷酸化激活，導(dǎo)致其下游通路p70S6K過度表達(dá)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病db/db小鼠大腦皮質(zhì)mTOR通路被激活，即mTOR及其下游激酶p70S6K的磷酸化水平均增加，表明腦內(nèi)AchE表達(dá)上調(diào)可能與mTOR通路激活有關(guān)。

由于PI3K/Akt是調(diào)控mTOR信號的重要通路之一［7］，本研究對慢性2型糖尿病db/db小鼠腹腔注射PI3K抑制劑LY294002后，其大腦皮質(zhì)AchE表達(dá)降低、mTOR/p70S6K通路被抑制，提示PI3K/Akt/mTOR通路激活介導(dǎo)了糖尿病狀態(tài)下腦內(nèi)AchE的表達(dá)上調(diào)。研究表明，氧化應(yīng)激可以激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，阻斷該通路可以減少視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的凋亡［18］。大量研究表明，ROS過多激活了PI3K/Akt/mTOR通路，促進(jìn)了糖尿病并發(fā)癥如腎病和心血管疾病的發(fā)生［19，20］。本研究發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑LY294002可以通過降低氧化應(yīng)激水平，從而抑制mTOR及下游p70S6K的磷酸化。在本研究中PI3K抑制劑LY294002對db/db小鼠的血糖無明顯影響，從而排除了PI3K抑制劑通過影響血糖而間接影響mTOR通路的可能。Ma等［21］報道，在2型糖尿病大鼠海馬中，mTOR通路激活可能與胰島素信號通路損害有關(guān)，進(jìn)一步說明PI3K/Akt通路可能參與了糖尿病狀態(tài)下腦內(nèi)mTOR通路的激活。此外，我們前期研究［22］發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)的中樞神經(jīng)細(xì)胞系HT-22細(xì)胞及1型糖尿病大鼠腦內(nèi)AchE表達(dá)上調(diào)與PI3K/Akt/mTOR通路激活有關(guān)。

綜上所述，在糖尿病狀態(tài)下大腦皮質(zhì)AchE表達(dá)發(fā)生上調(diào)，這與PI3K/Akt/mTOR通路激活有關(guān)，可能為糖尿病性認(rèn)知功能障礙發(fā)生的機(jī)制之一。PI3K抑制劑LY294002是通過降低氧化應(yīng)激水平，抑制mTOR相關(guān)通路的活性，減少AchE表達(dá)，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用，可為糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能障礙的防治提供研究靶點(diǎn)。