吳和 楊強(qiáng)麗 賴泳

【摘?要】目的：研究水飛薊賓單用及合用肝龍含藥血清對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖活性的影響及機(jī)制。方法：通過血清藥理學(xué)方法制備含藥血清，采用MTT法檢測水飛薊賓單用及合用肝龍含藥血清對肝星狀細(xì)胞增殖的影響，并用激光共聚焦測定其細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。結(jié)果：與單用水飛薊賓相比，水飛薊賓合用肝龍含藥血清作用肝星狀細(xì)胞24、48、72h能夠顯著抑制肝星狀細(xì)胞的增殖（P<0.01）;30%水飛薊賓聯(lián)合肝龍（7.5%、15%、30%）含藥血清在一定程度上可使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度降低。結(jié)論：肝龍能增強(qiáng)水飛薊賓在體外對肝星狀細(xì)胞的抑制作用，且其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肝龍膠囊;肝纖維化;水飛薊賓;Ca2+濃度;肝星狀細(xì)胞

【中圖分類號】R965?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）6-0014-04

肝纖維化是由于各種原因?qū)е碌穆愿螕p傷過程，可使以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrixc， ECM）在肝臟中大量沉積。肝纖維化如果沒有及時有效的治療，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，并誘發(fā)肝細(xì)胞功能障礙及門靜脈高壓等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重則可能導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[1]。但是肝纖維化是可逆的，及時阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，是防治肝硬化和慢性肝病，提高肝病患者的生命質(zhì)量和生存率的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells， HSC）的活化增殖是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，HSC被激活后可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并誘導(dǎo)促纖維化細(xì)胞因子的分泌，增加膠原的合成，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[2-5]。Ca2+對細(xì)胞生理活動起到極其重要的調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加是細(xì)胞增殖分裂的必要條件[6-7]。在HSC活化過程中，細(xì)胞內(nèi)Ca2+是諸多生長因子、氧化應(yīng)激產(chǎn)物及細(xì)胞因子等發(fā)揮促生長和增殖作用的主要介質(zhì)之一，因此通過測定HSC內(nèi)Ca2+濃度可以間接了解其生長情況。

近年來許多藥物如秋水仙堿、還原型谷胱甘肽、水飛薊賓等都被用于肝纖維化的治療，但臨床效果卻不理想[8]。水飛薊賓（Silybin， SF）是水飛薊素中含量最高、活性最強(qiáng)的成分，因其具有抗炎、抗氧化和抗纖維化等藥理作用，臨床廣泛用于各種肝膽疾病的治療[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物具有促進(jìn)組織修復(fù)、消炎止痛、抗肝纖維化和抗腫瘤，增強(qiáng)免疫活性等藥理作用[11-12]。肝龍膠囊（Ganlong capsule， GL）是從美洲大蠊中提取的以粘糖氨酸和復(fù)合核苷類為主要成分的抗肝炎新藥[13]，具有療效確切＼不良反應(yīng)少等優(yōu)點，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛用于臨床實踐。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，單用水飛薊賓對HSC的抑制作用不如水飛薊賓聯(lián)合肝龍。含藥血清經(jīng)過了機(jī)體代謝可以更好的模擬藥物的最終有效成分，更接近藥物在體內(nèi)的藥理效應(yīng)，從而可以更準(zhǔn)確的研究其藥理機(jī)制。本研究選用大鼠HSC，分別給予水飛薊賓單用及水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清處理，觀察其對HSC增殖活性的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1?材料和方法

1.1?材料與試劑

1.1.1?實驗材料?SD雄性健康成年大鼠，體重（180±20）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證：SCXK（湘）2011-0003;大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）購自中科院昆明細(xì)胞庫（編號：KCB200703YJ）。

1.1.2?藥物與試劑?水飛薊賓膠囊（批號：16041601，天津天士力圣特制藥有限公司）;肝龍膠囊（批號：550706087，昆明賽諾制藥有限公司）;胎牛血清（美國Gibco公司）;噻唑藍(lán)（MTT）、Hepes（北京索萊寶科技有限公司）;DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）;碳酸氫鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）;Fluo-3/AM（美國Millipore公司）。

1.2?儀器與設(shè)備?二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific）;CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus）;離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）;TCS SP8激光掃描共聚焦顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司）。

1.3?方法

1.3.1?含藥血清的制備?SD雄性大鼠隨機(jī)分為肝龍組（150mg/kg），水飛薊賓組（28mg/kg）及空白對照組（0.9% NaCl溶液），按1mL/100g給藥容量，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃7d，最后一次灌胃前禁食不禁水12h，末次灌胃給藥1h后，用異氟烷麻醉腹主動脈取血，采用一次性非抗凝真空采血管收集全血，靜置4h，3000r/min離心10min，分離血清，經(jīng)56 ℃恒溫滅活30min，0.22μm微孔濾膜除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2?HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)及藥物分組?從-80℃超低溫冰箱取出HSC-T6細(xì)胞，用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素抗生素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)80%～90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，實驗時選取對數(shù)期生長良好的細(xì)胞。根據(jù)水飛薊賓含藥血清（7.5%、15%、30%）及肝龍膠囊含藥血清（7.5%、15%、30%）進(jìn)行2因素3水平完全實驗設(shè)計，同時設(shè)空白血清對照組，水飛薊賓及肝龍膠囊含藥血清濃度編號見表1。

1.3.3?MTT法檢測水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對HSC增殖的影響?用0.25%的胰酶將處于對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞消化后，用細(xì)胞計數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，使細(xì)胞密度為6×104個/mL接種于96孔板，細(xì)胞懸液終體積為100μL，置于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行無菌培養(yǎng)24h，待細(xì)胞生長旺盛貼壁后更換不同濃度含藥血清的培養(yǎng)基及空白培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72h。棄去舊培養(yǎng)基用PBS小心清洗2遍，將20μL濃度為5mg/mL的MTT依次加入各孔，繼續(xù)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4h，之后每孔分別加入150μL的DMSO，充分振蕩，使甲臜充分溶解，用多功能酶標(biāo)儀在490nm波長處檢測其吸光度值（A490）。

細(xì)胞存活率=（OD藥物組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）;

細(xì)胞抑制率=1-（OD藥物組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）。

1.3.4?激光掃描共聚顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度?根據(jù)水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對HSC增殖作用的影響發(fā)現(xiàn)，30%水飛薊賓聯(lián)合不同濃度肝龍含藥血清對HSC的抑制作用較好，故本次研究用激光掃描共聚顯微鏡檢測其對細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的影響。將培養(yǎng)的細(xì)胞取出，棄去含胎牛血清培養(yǎng)基，用HBSS溶液洗滌細(xì)胞至少3次;在每孔細(xì)胞中加入30μL Fluo 3-AM工作液;37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，之后除去工作液，為充分洗去工作液，加入HBSS溶液清洗細(xì)胞3次，然后每孔加入20μLHBSS溶液覆蓋細(xì)胞;37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育約25min后，用激光共聚焦顯微鏡來檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。設(shè)置掃描條件：20×倍鏡下、激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長525nm，10%激光強(qiáng)度、PMT（1100）。計算整個細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，記錄熒光強(qiáng)度的相對值（%）以觀察Ca2+濃度動態(tài)變化。計算公式：Ca2+濃度=Kd（ F-Fmin）/（ Fmax-F）。（F：實時熒光強(qiáng)度;Fmax：0.1%TritonX-100 測得的熒光強(qiáng)度值;Fmin：5 mM EGTA 測得的熒光強(qiáng)度值;Kd =400nmol/L）[14]。

1.4?統(tǒng)計學(xué)方法?數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件處理，兩組間比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對HSC增殖的作用?不同濃度水飛薊賓單用及聯(lián)合不同濃度肝龍含藥血清分別作用HSC24、48和72h，單用7.5%和15%水飛薊賓含藥血清組對HSC的增殖作用不明顯（P>0.05），單用30%水飛薊賓含藥血清處理24h時，其抑制率為16.5%;水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清組對HSC抑制作用顯著高于單用水飛薊賓含藥血清組（P<0.01）。見表2。

2.2?30%水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清對HSC內(nèi)Ca2+濃度的影響?在單獨用藥情況下：與空白血清組相比，水飛薊賓組HSC內(nèi)Ca2+濃度在24、48、72h分別降低27.80%、67.06%、50.70%;聯(lián)合用藥時：與單用水飛薊賓含藥血清組相比，水飛薊賓+7.5%肝龍組HSC內(nèi)Ca2+濃度在24 h時一過性增加，隨著作用時間的延長，在48h時HSC內(nèi)Ca2+濃度降低26.49%，在72h 時HSC內(nèi)Ca2+濃度增加29.34%;水飛薊賓+15%肝龍組HSC內(nèi)Ca2+濃度在24、48、72h分別降低13.46%、29.34%、36.49%;水飛薊賓+30%肝龍組HSC內(nèi)Ca2+濃度在24、48h分別增加0.78%、26.77%，在72h降低15.97%。如圖1所示。

3?討論

近年來我國肝硬化、肝癌的患病率居高不下，肝纖維化作為這兩大疾病的必經(jīng)階段，是一個可逆的過程。本研究以大鼠為實驗對象，研究水飛薊賓單用及聯(lián)合肝龍含藥血清在體外對HSC增殖活性的影響，結(jié)果表明水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清對HSC的抑制作用強(qiáng)于單用水飛薊賓，隨著對肝纖維化機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，正常肝細(xì)胞經(jīng)酒精、病毒、藥物等作用損傷，產(chǎn)生炎癥，刺激并激活HSC，激活的HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步誘發(fā)促纖維化細(xì)胞因子分泌和增加膠原的合成，使細(xì)胞外基質(zhì)過量產(chǎn)生，引起肝纖維化[2-3]。HSC在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的增殖能力明顯增強(qiáng)。因此認(rèn)為可以通過抑制HSC的活化和增殖來逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

通過激光共聚焦測定HSC內(nèi)Ca2+濃度發(fā)現(xiàn)，與單用水飛薊賓相比，肝龍聯(lián)合水飛薊賓含藥血清在一定程度上可使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯降低，其中水飛薊賓聯(lián)合15%肝龍含藥血清時，HSC內(nèi)游離Ca2+濃度降低最為明顯。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與HSC生長和增殖作用密切相關(guān)，它能參與諸多細(xì)胞因子、生長因子及氧化應(yīng)激產(chǎn)物等對HSC的調(diào)控。這些因子通過增加細(xì)胞膜鈣通道活性，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，引起HSC的收縮和有絲分裂[7]。并且，已有研究表明[15]大鼠HSC內(nèi)Ca2+濃度增加會引起HSC收縮。值得注意的是，與單用水飛薊賓組相比，水飛薊賓聯(lián)合肝龍含藥血清作用HSC 24、48h，在肝龍含藥血清濃度為15%時可降低HSC內(nèi)游離Ca2+濃度，而在肝龍含藥血清濃度為30%時可增加HSC內(nèi)游離Ca2+濃度，在一定程度上表現(xiàn)出肝龍對HSC內(nèi)游離Ca2+具有雙向調(diào)節(jié)作用。推測肝龍對Ca2+的抑制與促進(jìn)作用可能與藥物濃度、作用時間和藥物的體內(nèi)代謝有關(guān)，而對不同疾病還需要考慮病情來選擇最佳給藥劑量，但這還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，肝龍能夠增強(qiáng)水飛薊賓含藥血清對HSC的抑制作用，從而達(dá)到增強(qiáng)在體外的抗肝纖維化的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。但本次實驗尚存在許多不足，本研究所用的細(xì)胞為大鼠肝星狀細(xì)胞，與人源細(xì)胞存在一定的種屬差異，因此下一步可以選用人源細(xì)胞作為實驗對象來加以證實，同時對肝龍的體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)進(jìn)行研究，為臨床水飛薊賓和肝龍膠囊的聯(lián)合應(yīng)用提供更充分的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]張偉，賈繼東. 肝纖維化的發(fā)病機(jī)制及治療新靶點 [J].臨床肝膽病雜志，2017，33（3）：409-412.

[2]Atzori L， Poli G， Perra A. Hepatic stellate cell： a star cell in the liver [J]. Int J Biochem Cell Biol， 2009， 41（8-9）： 1639-1642.

[3]Novo E， di Bonzo LV， Cannito S， et al. Hepatic myofibroblasts： a heterogeneous population of multifunctional cells in liver fibrogenesis [J]. Int J Biochem Cell Biol， 2009， 41（11）： 2089-2093.

[4]De Minicis S， Candelaresi C， Marzioni M， et al. Role of endogenous opioids in modulating HSC activity in vitro and liver fibrosis in vivo[J]. Gut， 2008， 57（3）：352-364.

[5]Wallace M C， Friedman S L， Mann D A. Emerging and disease-specific mechanisms of hepatic stellate cell activation[J]. Seminars in Liver Disease， 2015， 35（2）：107-118.

[6]吳曉玲，曾維政，蔣明德，等. 肝纖維化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 [J].世界華人消化雜志，2006，14 （22）：2223-2228.

[7]鮑佳春，袁鳳來，陸偉國，等. 肝星狀細(xì)胞激活與增殖相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化中的作用及機(jī)制 [J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009，14（4）：455-459.

[8]Huang H， Zhou J， Cui Z， et al. Angiotensin II type 1 receptorassociated protein plays a role in regulating the local reninangiotensin system in HSCT6 cells[J]. Molecular Medicine Reports， 2015， 12（3）：3763-3768.

[9]Loguercio C， Festi D. Silybin and the liver： From basic research to clinical practice [J]. World Journal of Gastroenterology， 2011， 17（18）：2288-2301.

[10]劉佳鑫，齊文，彭希鳳，等.HPLC法同時測定水飛薊果實不同部位及其提取物中水飛薊亭等7種黃酮類成分的含量 [J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2016（1）：56-62.

[11]陳思如. 美洲大蠊提取物抗肝纖維化機(jī)理的體外研究 [D].昆明：昆明醫(yī)科大學(xué)，2014.

[12]于珊珊，張華，張婷婷，等.美洲大蠊藥理作用及臨床應(yīng)用研究 [J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016 （4）：228-231.

[13]羅萬玲. 美洲大蠊和巖陀的化學(xué)成分研究 [D].昆明：昆明理工大學(xué)，2007.

[14]張四洋，周末，高建，等. Ca2+熒光蛋白探針Cameleon和熒光染料探針fluo 3測定H2O2刺激的A549細(xì)胞中Ca2+濃度變化 [J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22（7）：1497-1501.

[15]Laleman W， Van L L， Severi T， et al. Both Ca2+ - dependent and -independent pathways are involved in rat hepatic stellate cell contraction and intrahepatic hyperresponsiveness to methoxamine [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2007， 292（2）： 556-564.

（收稿日期：2019-01-17?編輯：程鵬飛）