羅 雨，許 佳，張超穎，蔣春燕，章紅兵

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院動物醫(yī)學(xué)檢測中心，浙江 金華 321000)

白介素-17(IL-17)細胞因子家族包括6個成員：IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也稱 IL-25)和 IL-17F[1]。IL-17C主要表達于腸道等粘膜組織中的上皮細胞，能誘導(dǎo)緊密連接蛋白及抗菌蛋白的表達進而調(diào)節(jié)腸粘膜免疫[2-4]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，豬腸上皮細胞系IPEC-J2在細菌感染后能通過上調(diào)IL-17C的表達進而促進粘膜免疫[5]。金華豬，又稱“金華兩頭烏”，是我國著名的優(yōu)良豬種之一，具有肉質(zhì)好、繁殖率高、抗逆性強等優(yōu)良特性。長白豬具有生長速度快和飼料利用率高，但該品種抗病能力相對較差[6]。為進一步研究IL-17C在豬腸道免疫中的作用，本文對比分析了IL-17C細胞因子在金華豬與長白豬腸道中的表達特性，以期從分子水平揭示兩品種豬抗病性能差異的原因。

1 材料與方法

1.1樣品采集 選取180 日齡去勢金華公豬和長白公豬各6頭，屠宰后分別采集空腸及回腸中段組織。用預(yù)冷的生理鹽水沖洗掉內(nèi)容物后，分別浸入于含TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific)的1.5 mL EP管中或者含甲基纖維素(Sigma-Aldrich)的平底凍存管中，然后投入液氮中迅速冷凍后置于-80℃冰箱保存。

1.2qRT-PCR 按照Trizol Reagent的操作說明提取腸道組織中的總RNA，選取1 μg純化后的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以GAPDH和β-actin為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR方法檢測IL-17C mRNA在金華豬與長白豬空腸及回腸中的表達量。引物及退火溫度見表1，具體操作方法參考文獻[5]。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3腸道組織切片及染色鏡檢 切片制作及染色方法參考文獻[7]，一抗與熒光二抗分別為兔抗-IL-17C (1:1000，ab153896，Abcam)及羊抗兔異硫氰酸熒光素?zé)晒舛?碧云天)。染色完成后用0.223 M 1,4-二氮雜二環(huán) [2.2.2] 辛烷(Sigma-Aldrich)的甘油封片后熒光顯微鏡鏡檢(奧林巴斯BX43)。

1.4數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 22軟件進行Mann-Whitney U檢驗和Friedman′s測試，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1IL-17C基因在不同腸道中的表達 由圖1可見，IL-17C基因在金華豬及長白豬空腸及回腸中均有表達，且在不同品種間存在差異。金華豬腸道IL-17C基因表達量均高于長白豬，其中在空腸中的表達量顯著高于長白豬(P<0.05)。同時，兩品種豬IL-17C基因在不同腸道部位的表達存在明顯差異，回腸中的基因表達量顯著高于空腸(P<0.01)。

圖1 IL-17C基因在金華豬和長白豬腸道中的表達(不同字母代表差異顯著)

2.2IL-17C蛋白在空腸中的表達 免疫熒光結(jié)果顯示，金華豬IL-17C蛋白在空腸中的表達顯著高于長白豬，且主要集中于隱窩處(圖2，右向箭頭所示)。此外，在金華豬腸絨毛上皮細胞中也發(fā)現(xiàn)有IL-17C的表達(圖2，左向箭頭所示)，而在長白豬腸上皮細胞中未發(fā)現(xiàn)該蛋白的存在。

圖2 金華豬及長白豬空腸中IL-17C蛋白免疫熒光檢測

3 討論

IL-17C基因在腸道中的主要作用是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和維持粘膜屏障功能[8]。目前，關(guān)于IL-17C及其腸道免疫調(diào)節(jié)的研究主要集中于人及小鼠模型中。本團隊前期研究表明，IL-17C基因能表達于豬腸上皮細胞系IPEC-J2中[5]。本試驗進一步研究了IL-17C在豬腸道組織中的分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)IL-17C細胞因子在金華豬及長白豬腸道中的表達存在明顯差異。在金華豬腸道內(nèi)，尤其是空腸IL-17C的表達量顯著高于長白豬。IL-17C主要表達于隱窩處的腸上皮細胞，與在人腸道中的研究結(jié)果一致[9]。有研究表明，金華豬腸道內(nèi)β-防御素-2 (pBD-2)等防御蛋白的水平顯著高于長白豬[10]。在豬腸上皮細胞中，IL-17C能夠調(diào)控黏膜免疫相關(guān)基因(pBD-2，mucin-2，claudin-1和claudin-2)的表達，進而能有效抵抗細菌的感染和入侵[5]。因此，IL-17C可能在豬腸道先天免疫中發(fā)揮著重要的作用。IL-17C在金華豬及長白豬腸道的表達差異可能從分子水平闡釋了地方品種豬抗病力優(yōu)于引進品種豬的機制。本研究為進一步研究不同品種豬腸道免疫力及抗病力之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。