孔曉武　丁青　張琦

[摘要] 目的 探討AMPK抑制TGF-β信號通路減輕EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移機制。 方法 采用Lipofectamine2000介導(dǎo)AMPKα1轉(zhuǎn)染至人膀胱移行上皮癌BIU-87，噻唑藍（MTT）比色法和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測shRNA對細胞增殖和凋亡的作用。細胞劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗檢測體外細胞遷移和侵襲能力。Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達情況。 結(jié)果 轉(zhuǎn)染后的C4-2 DN細胞生長速度明顯慢于未轉(zhuǎn)染的BIU-87細胞及轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E細胞，且在24 h內(nèi)的細胞凋亡率均明顯高于轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。AMPK抑制TGF-β信號通路能夠抑制人膀胱移行上皮癌BIU-87細胞的增殖和侵襲遷移（P<0.05）。同時，AMPK抑制TGF-β信號通路下調(diào)N-cadherin 和 Vimentin 蛋白水平，上調(diào)E-cadherin 蛋白表達。 結(jié)論 AMPK抑制TGF-β信號通路下調(diào)N-cadherin 和 Vimentin 蛋白水平，上調(diào)E-cadherin 蛋白表達，減輕EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] AMPK;TGF-β信號通路;EMT;膀胱癌;轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R737.14? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）12-0028-04

Mechanism research of AMPK in inhibiting TGF-β signaling pathway and alleviating the metastasis of EMT-induced bladder cancer

KONG Xiaowu1? ?DING Qing2? ?ZHANG Qi2

1.Department of Urology， Zhejiang Provincial People's Hospital Haining Hospital， Haining Central Hospital， Haining 314408， China; 2.Department of Urology， Zhejiang Provincial People's Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To investigate the role of AMPK in inhibiting TGF-β signaling pathway and attenuating EMT-induced bladder cancer metastasis. Methods Lipofectamine2000 was used to mediate AMPKα1 transfection into human bladder transitional cell carcinoma BIU-87. The effect of shRNA on cell proliferation and apoptosis was detected by MTT colorimetric assay and AnnexinV-FITC/PI double staining. Cell scratch assay and Transwell chamber invasion assay were used to detect cell migration and invasion in vitro. The expression of E-cadherin， N-cadherin and Vimentin protein was detected by Western blot. Results The growth rate of C4-2 DN cells after transfection was significantly slower than that of untransfected BIU-87 cells and C4-2 E cells transfected with empty vector， and the apoptosis rate of C4-2 DN cells after transfection was significantly higher than that of C4-2 E cells transfected with empty vector transfection within 24 h， and the difference between groups was statistically significant （P<0.05）. AMPK inhibits proliferation and invasion and migration of human bladder transitional epithelial carcinoma BIU-87 cells by inhibiting TGF-β signaling pathway （P<0.05）. At the same time， AMPK inhibits TGF-β signaling pathway and down-regulates N-cadherin and Vimentin protein levels， and up-regulates E-cadherin protein expression. Conclusion AMPK inhibits TGF-β signaling pathway， down-regulates N-cadherin and Vimentin protein levels， up-regulates E-cadherin protein expression， and reduces EMT-induced bladder cancer metastasis.

[Key words] AMPK; TGF-β signaling; EMT; Bladder cancer; Metastasis

膀胱癌為泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，根據(jù)浸潤程度不同分為肌層浸潤性膀胱癌和非肌層浸潤性膀胱癌兩種。相關(guān)研究[1]結(jié)果顯示，肌層浸潤性膀胱癌遠處轉(zhuǎn)移程度高，病情進展快，5年存活率低于10%。因該類癌癥的發(fā)生與發(fā)展過程極為復(fù)雜，涉及多種抑癌基因及通路的抑制與激活情況[2]。故研究這些基因以及其中通路因子對癌癥發(fā)生、轉(zhuǎn)移的影響，對癌癥的治療以及預(yù)防具有一定意義。上游蛋白激酶（AMPK）是公認(rèn)的具有抑癌功能的功能性物質(zhì)，因腫瘤組織微環(huán)境或基因突變所致的AMPK活性下降是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制[3]。以往研究[4]表明，AMPK通過限制細胞周期檢查點或能量瓶頸，促進細胞凋亡，抑制增殖。轉(zhuǎn)化生長因子 β（TGF-β）信號的過度活躍則是腫瘤細胞復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的誘因，TGF-β通過誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進腫瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移[5-6]。但目前有關(guān)過度活躍的TGF-β 信號與AMPK活性下降是否有關(guān)，以及激活A(yù)MPK對TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、EMT、腫瘤轉(zhuǎn)移的作用均鮮有報道。本研究通過考察AMPK對TGF-β信號及EMT 標(biāo)志物的影響，探討AMPK抑制TGF-β信號通路減輕EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移機制?，F(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1 一般材料

2017年9月～2018年5月選用人膀胱移行上皮癌BIU-87，由上海市腫瘤研究所癌基因國家重點實驗室提供。二甲基亞砜及四甲基偶氮唑藍購自美國Sigma公司。LipofectamineTM轉(zhuǎn)染劑購自LTI公司。培養(yǎng)基、胎牛血清、單克隆抗體Vimentin、N-cadherin、E-cadherin購自上?；鶢栴D生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)? 采用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基（含0.1%鏈霉素及青霉素）培養(yǎng)BIU-87為人膀胱移行上皮癌細胞株，在37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。以不轉(zhuǎn)染AMPKα1人膀胱移行上皮癌BIU-87細胞為對照組，以Lipofectamine2000介導(dǎo)AMPKα1轉(zhuǎn)染至人膀胱移行上皮癌BIU-87細胞為實驗組。

1.2.2 AMPK DN細胞株構(gòu)建? 將AMPKα1亞單位顯性失活突變體（DN）、慢病毒包裝質(zhì)粒、Lipofectamine 2000 按比例均勻滴入BIU-87細胞培養(yǎng)液，6 h后更換不含上述物質(zhì)的新鮮培養(yǎng)液，孵育過夜，收集培養(yǎng)液上清，觀察細胞，上清液濃縮后儲存在-80℃冰箱。此外，將以 Scramble DNA代替目的基因轉(zhuǎn)染BIU-87細胞，為對照組（C4-2 E）細胞。

1.2.3 AMPK DN細胞株的篩選? 轉(zhuǎn)染72 h后，將1 μg/mL的Puromycin選擇培養(yǎng)液同時加入至3組細胞中并進行篩選，每隔2 d換液1次，對AMPK DN基因慢病毒感染 C4-2細胞進行篩選，并構(gòu)建穩(wěn)定細胞株（C4-2 DN）。

1.2.4 細胞劃痕實驗? 先用記號筆每隔 0.5～1.0 cm在6孔板底面劃一橫線進行標(biāo)記，隨后每孔加入約5×105個細胞，培養(yǎng)過夜。PBS洗去細胞碎屑后，每個孔內(nèi)分別加入含血清、無血清、含藥物、含 TGF-β1因子的不同培養(yǎng)基，低倍鏡拍照，記錄0 h時細胞數(shù)量，培養(yǎng)24 h后，再次拍照，計算遷移速率。

1.2.5 Transwell小室侵襲實驗? 將2×105個BIU-87細胞接種于8 μm 孔徑小室，下室加入含5 ng/mL TGF-β1培養(yǎng)液，上室則加入 10 mM AMPK抑制劑（二甲雙胍）。孵育過夜后，采用多聚甲醛溶液固定，室溫風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，PBS清洗晾干后，100倍顯微鏡下觀察并計數(shù)細胞。

1.2.6 檢測細胞增殖并繪制細胞生長曲線[7]? 將C4-2 E細胞、C4-2 DN細胞、未轉(zhuǎn)染BIU-87細胞分別以每孔2×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板，并設(shè)不加細胞僅加培養(yǎng)液的試驗孔為空白對照孔。接種2 d后轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染24 h、48 h以及72 h棄去培養(yǎng)液，測定OD值。計算細胞生長率。接種2 d后每天取每種細胞6孔，通過四唑鹽比色試驗（MTT）法檢測細胞活性。在波長為492 nm下，讀取酶標(biāo)儀上測定的各孔吸光度（OD）值，最終結(jié)果為6孔平均值，并以時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制細胞生長曲線。

1.2.7 檢測細胞凋亡? 分別于24 h、48 h、72 h 3個時相點收集C4-2 DN細胞及對照組細胞，制成濃度為 5×106/mL的細胞懸液，加1×105個細胞至流式管內(nèi)，PBS洗滌3次，離心取沉淀，加入5 μL的 AnnexinV-FITC和PI，避光室溫放置5 min。60 min內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。PI通過FL2通道檢測紅色熒光，AnnexinV-FITC 通過FL1通道檢測綠色熒光。若AnnexinV-FITC與PI均為陽性，則為壞死細胞或晚期凋亡細胞，若AnnexinV-FITC陽性，PI陰性則為早期凋亡細胞，反之為正常細胞。

1.2.8 實時定量 PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄水平的表達變化? 細胞經(jīng)處理后用 Trizol 法提取總 RNA，定量后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成 cDNA。隨后通過實時定量 PCR 進行擴增，并利用BioRad CFX Manager軟件進行定量分析。

其中引物序列如下：E-cadherin 正義5'-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3'，反義5'-GGGTGTCGAG-GGAAAAATAGG-3';N-cadherin正義5'-TCAG-GCGTCTGTAGAGGCTT-3'，反義5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3';Vi-mentin正義5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3'，反義5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3';β-actin正義5'-CATGTACGT-TGCTATCCAGGC-3'，反義5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。

1.2.9 Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達情況[8]? 將細胞中的組織蛋白采用蛋白裂解液法進行提取，并通過Western blot法檢測其中的E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS19. 0 統(tǒng)計軟件包進行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組細胞的生長曲線

由封三圖6、7可知，轉(zhuǎn)染空載體BIU-87的細胞生長曲線與BIU-87細胞相似，而C4-2 DN細胞生長速度明顯慢于未轉(zhuǎn)染的BIU-87細胞及轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E細胞。BIU-87細胞生長7 h細胞數(shù)為（600.35±121.46），C4-2 DN細胞生長7 h細胞數(shù)為（325.14±102.47），C4-2 E細胞生長7 h細胞數(shù)為（598.77±119.58），三組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.720，P=0.002）。

2.2 不同組細胞的凋亡

C4-2 DN細胞在24 h、48 h及72 h細胞凋亡率均明顯高于轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E的細胞，且組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見封三圖8、圖1及表1。

2.3 AMPK抑制TGF-β誘導(dǎo)的細胞遷移

進行細胞劃痕實驗時，分別給TGF-β1、AMPK 激活劑處理，24 h時后觀察結(jié)果顯示，AMPK 激活劑處理的劃痕間距明顯寬于TGF-β1 因子刺激組。隨后的transwell實驗結(jié)果顯示，AMPK 激活劑處理組遷移細胞數(shù)（0.23±0.02）明顯少于TGF-β1 因子刺激組（0.59±0.11），組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.256，P=0.00），見封三圖9、10。

2.4 AMPK對膀胱癌細胞EMT的影響

實時定量PCR顯示，AMPK 激活劑處理后細胞內(nèi)E-cadherin 的 mRNA水平上調(diào)，N-Cadherin和Vimentin的mRNA水平下調(diào)（P<0.05，表2）。此外，通過Western blot發(fā)現(xiàn)AMPK 激活劑處理后細胞內(nèi)的N-Cadherin和Vimentin蛋白水平明顯下調(diào)，E-cadherin蛋白表達上調(diào)，見圖2。

3討論

本研究主要比較不同轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組之間的細胞生長規(guī)律，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體BIU-87的細胞生長曲線與BIU-87細胞相似，而C4-2 DN細胞生長速度明顯慢于未轉(zhuǎn)染的BIU-87細胞及轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E細胞，且C4-2 DN細胞在24 h細胞凋亡率均明顯高于C4-2 E細胞，提示轉(zhuǎn)染AMPK能夠抑制BIU-87細胞的生長;對比轉(zhuǎn)染AMPK的C4-2 DN細胞與僅轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E細胞兩者生長情況后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染AMPK的C4-2 DN細胞生長速率明顯低于僅轉(zhuǎn)染空載體的C4-2 E細胞，在24 h凋亡率均明顯高于轉(zhuǎn)染空載體C4-2 E細胞，進一步驗證了抑制BIU-87細胞生長的因素是AMPK，而不是載體Lipofectamine2000。分析AMPK抑制膀胱癌細胞生長的機制，可能與以下機制有關(guān)：（1）AMPK 具有抑制TSC2-mTOR蛋白合成，間接地抑制腫瘤細胞生長與增殖的功能[9-10];（2）AMPK 通過調(diào)節(jié) p53-p21表達，從而平衡細胞的增殖與凋亡，調(diào)控細胞周期[11];（3）AMPK通過上調(diào)p53蛋白水平，阻斷細胞周期，促進腫瘤細胞凋亡[12-13];（4）AMPK能夠抑制TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化，阻斷Smad2/3核定位[14]，從而阻礙腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。

為進一步探討AMPK與TGF-β 信號通路間的關(guān)系，本研究分別給TGF-β1、AMPK 激活劑處理BIU-87細胞進行細胞劃痕試驗，結(jié)果顯示，AMPK激活劑處理的劃痕間距明顯寬于TGF-β1因子刺激組，提示AMPK對于細胞遷移的抑制作用與TGF-β信號通路有關(guān)。而Transwell實驗結(jié)果也證實了這一點，AMPK激活劑處理組遷移細胞數(shù)明顯少于TGF-β1因子刺激組（P<0.05）。經(jīng)Lin H等[14]研究證實，AMPK 可通過抑制 Smad2/3 靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄，從而降低TGF-β促轉(zhuǎn)移作用。

EMT是由上皮細胞變?yōu)殚g質(zhì)細胞的過程，參與腫瘤細胞遠處遷移和局部浸潤。既往研究[15-17]表明，腫瘤細胞通過 EMT獲取間質(zhì)細胞的侵襲性，從而浸潤至相鄰組織，最終形成腫瘤細胞的遠端轉(zhuǎn)移。此外，EMT過程中MMPs、N-cadherin、纖維連接蛋白（Fi-bronectin）、波形蛋白（Vimentin）等間質(zhì)細胞因子表達增加，E-鈣黏著蛋白（E-cadherin）的合成受到抑制，細胞極性降低，緊密連接破壞，間質(zhì)特征增強[18]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMPK激活劑處理后細胞內(nèi)的N-cadherin和Vimentin蛋白水平明顯下調(diào)，E-cadherin蛋白表達上調(diào)，提示AMPK具有抑制EMT進程的能力。由于TGF-β/Smad信號通路是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵通路[19]，AMPK能夠阻斷TGF-β/Smad信號通路，因此也能夠抑制EMT進程，從而影響上皮細胞特征標(biāo)志物（N-cadherin、Vimentin、E-cadherin等）的表達。Bays JL等[20]發(fā)現(xiàn)，增強AMPK的活性，能夠明顯降低N-Cadherin和Vimentin蛋白水平，抑制腫瘤細胞的侵襲能力，降低腫瘤細胞的惡性程度。

綜上所述，AMPK活性大小與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，其在人體內(nèi)的表達缺失、突變或許是膀胱癌早期癌變的預(yù)兆，AMPK通過抑制TGF-β信號通路減輕EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移，有望成為膀胱癌未來診斷以及治療的潛在靶標(biāo)，為疾病的治療提供新思路。

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