劉 寧,劉昌奎,郭 芳,黃 碩,李 芳

(1 西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科學(xué)教研室,西安 710021;2 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科;*通訊作者,E-mail:ningliu@xiyi.edu.cn)

近年來隨著種植治療患者的逐年增多,種植體周圍炎的發(fā)生率急速增加。種植體周圍炎成為影響種植治療效果,導(dǎo)致種植體脫落失敗的重要病因[1]。北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院對種植修復(fù)效果10年回顧性研究結(jié)果表明,因種植體周圍炎骨吸收導(dǎo)致種植體脫落的種植體數(shù)占總脫落種植體數(shù)的97.06%[2],種植體周圍炎的有效治療成為亟待解決的關(guān)鍵問題。去蛋白牛骨無機(jī)材料(deproteinized bovine bone,DBB)是目前臨床廣泛應(yīng)用的治療種植體周圍骨缺損的骨替代材料,但是缺乏成骨誘導(dǎo)能力,限制其成骨效果[3]。淫羊藿苷(icariin,ICA)是一種良好的骨性誘導(dǎo)因子[4],課題組前期通過仿生磷酸鈣涂層技術(shù)將ICA負(fù)載到DBB上,檢測改性DBB的生物相容性和體外成骨誘導(dǎo)能力[5]。本研究將改性DBB材料移植入大鼠背部皮下,檢測改性DBB在動物體內(nèi)異位成骨的能力。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性SD大鼠6只,體質(zhì)量180-220 g,由空軍軍醫(yī)大學(xué)(原第四軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器

PBS緩沖液(Hyclone公司,美國),戊巴比妥鈉(Sigma公司,美國),多聚甲醛固定液(上?；瘜W(xué)試劑廠,中國),淫羊藿苷(源葉生物有限公司,中國),青霉素、氯化鈉、碳酸氫鈉、二水合磷酸氫鈉、二水合氯化鎂、二水合氯化鈣、TRIS base(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,中國)。超凈工作臺(Thermo公司,美國),顯微鏡及照相系統(tǒng)(Nikon公司,日本)。

1.3 仿生礦化磷酸鈣涂層的制備

將0.1 g DBB材料浸泡在10 ml 5倍SBF溶液(684 mmol/L NaCl;21 mmol/L NaHCO3;5 mmol/L Na2HPO4·2H2O;7.5 mmol/L MgCl2·2H2O)中24 h,冷凍干燥,則在材料表面形成一層無定型CaP涂層。然后將其浸泡在1 ml飽和SBF溶液(2 mmol/L Na2HPO4·2H2O;40 mmol/L HCl;4 mmol/L CaCl2·2H2O;50 mmol/L TRIS base)中48 h,冷凍干燥,則在無定型CaP涂層表面形成結(jié)晶狀CaP涂層。如飽和SBF溶液中含有5 mg/L的ICA,ICA會隨著結(jié)晶狀CaP涂層的形成沉積到CaP晶體中。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及動物模型制備

實(shí)驗(yàn)分為三組:DBB組,未經(jīng)處理的DBB;CaP組,CaP涂層改性的DBB;ICA-CaP組,CaP涂層內(nèi)含有ICA的DBB。將各組材料置于96孔板中,每孔放入0.05 g材料(n=6),用PBS潤濕材料。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,剃除背部手術(shù)區(qū)毛發(fā),75%酒精消毒術(shù)區(qū)。用剪刀于每只大鼠背部做3個5 mm長縱形切口,將三組材料分別小心植入形成的盲袋內(nèi)。用縫線縫合切口,注意縫合時不要對植入材料形成外在壓力,并做好標(biāo)記,大鼠腹腔注射青霉素。術(shù)后觀察大鼠精神狀態(tài)、活動、飲食、切口愈合等一般情況。手術(shù)8周后過量戊巴比妥鈉腹腔注射處死大鼠,取出背部皮下的植入材料。

1.5 樣本組織學(xué)染色

1.5.1 樣本固定及切片制備 分離樣本外包筋膜等多余組織,將樣本用PBS漂洗。將組織塊浸泡于4%多聚甲醛,4 ℃條件下放置24 h。流水沖洗樣本,去除多聚甲醛。將組織塊浸泡于EDTA脫鈣溶液中脫鈣,每3 d更換一次溶液,持續(xù)14 d。常規(guī)脫水石蠟包埋,樣本10 μm切片,每個標(biāo)本切片4張,分別用于HE染色和Masson染色。

1.5.2 HE染色 常規(guī)脫蠟至水:二甲苯30 min,二甲苯30 min,無水乙醇5 min,無水乙醇5 min,95%乙醇5 min,85%乙醇5 min,75%乙醇5 min,PBS 5 min。樣本上滴加蘇木素染色液,染色1 min,PBS中浸泡5 min。樣本上滴加伊紅染色液,染色1 min,自來水沖掉染液。無水乙醇脫水,晾干,二甲苯中處理5 min,中性樹膠封片。

1.5.3 Masson染色 常規(guī)脫蠟至水同1.5.2。樣本上滴加蘇木素染色液,染色5 min,PBS中浸泡5 min。樣本上滴加復(fù)合染色液,染色5 min,自來水沖掉染液。樣本上滴加亮磷鉬酸,染色1 min,甩干。樣本上滴加亮綠色染色液,染色3 min,自來水沖掉染液。晾干,二甲苯中處理5 min,中性樹膠封片。

1.6 組織學(xué)觀察分析新生骨

每組選取6張HE染色切片,每張切片隨機(jī)選取3個視野,由2位雙盲實(shí)驗(yàn)者(對實(shí)驗(yàn)分組不了解的實(shí)驗(yàn)者)觀察,采用Image Pro Plus軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行半定量分析新生骨面積百分比。新生骨面積百分比=新生骨面積/切片截面總面積×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物一般情況觀察

所有大鼠均順利完成手術(shù)。大鼠術(shù)后飲食、活動良好,背部切口無紅腫、無滲出及裂開、愈合良好。到8周取材期大鼠全部存活,背部植入材料無丟失,各組植入材料均成近似圓形的硬性組織,中間厚,周邊薄。

2.2 HE染色觀察

HE染色切片結(jié)果顯示,DBB組的材料周圍包繞著纖維組織,少量新生骨樣組織存在(見圖1A)。CaP組的材料表面可見新生骨,散在分布(見圖1B)。ICA-CaP組的材料表面可見多處新生骨生成(見圖1C)。

2.3 Masson染色觀察

Masson染色切片結(jié)果顯示,DBB組的材料周圍包圍著綠色的纖維組織,少量新生骨存在(見圖2A);CaP組的材料表面可見紫紅色的新生骨(見圖2B);ICA-CaP組的材料表面可見多處紫紅色的新生骨生成(見圖2C)。

A. DBB組 B. CaP組 C. ICA-CaP組黑色三角:各組植入材料;黑色箭頭:新生骨圖1 大鼠背部異位成骨HE染色 (×100)Figure 1 HE staining of subcutaneous ectopic bone formation in the back of rats (×100)

A. DBB組 B. CaP組 C. ICA-CaP組黑色三角:各組植入材料;黑色箭頭:新生骨圖2 大鼠背部異位成骨Masson染色 (×100)Figure 2 Masson staining of subcutaneous ectopic bone formation in the back of rats (×100)

2.4 組織學(xué)半定量分析

HE染色切片半定量分析結(jié)果顯示,ICA-CaP組的新生骨面積百分比顯著高于DBB組和CaP組,各組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

3 討論

DBB是目前口腔臨床上廣泛應(yīng)用的商品化骨替代材料,商品名稱是Bio-Oss?。DBB的優(yōu)點(diǎn)是具有較高的親水性、三維立體的多孔結(jié)構(gòu)、與人體骨組織相似的晶體結(jié)構(gòu),然而其缺乏成骨誘導(dǎo)能力,不能促使多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化,限制其成骨效果[3,6]。ICA是從淫羊藿中提取的一種黃酮類化合物,分子式為C33H40O15,相對分子質(zhì)量為676.65。ICA是一種良好的成骨誘導(dǎo)因子,實(shí)驗(yàn)證實(shí)ICA能夠促進(jìn)骨髓、脂肪、牙周膜等組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[7-9]。仿生磷酸鈣涂層技術(shù)是一種簡便、高效的涂覆方法。在生理溫度和pH條件下,通過共沉積使具有生物活性的作用因子結(jié)合到礦化涂層的晶狀結(jié)構(gòu)中,從而賦予涂覆材料新的性能。并且通過仿生磷酸鈣涂層沉積結(jié)合在材料表面的成分將會緩慢釋放,從而達(dá)到作用效果[10,11]。本研究前期運(yùn)用仿生磷酸鈣涂層技術(shù)將ICA負(fù)載到DBB上,檢測其生物相容性和體外成骨誘導(dǎo)能力[5]。本研究將改性DBB材料移植入大鼠背部皮下,檢測改性DBB在動物體內(nèi)異位成骨的能力。

與其他兩組比較,* P<0.05圖3 大鼠背部異位成骨HE染色半定量分析Figure 3 Semi-quantitative analysis of HE staining of subcutaneous ectopic bone formation in the back of rats

異位成骨動物模型相對于原位成骨可以減少實(shí)驗(yàn)中影響成骨的變量,能評估材料的成骨誘導(dǎo)效果,大鼠皮下異位成骨模型操作方法簡單,應(yīng)用最為廣泛[12]。大鼠背部皮膚空間大,且鼠不易觸碰傷口的縫線,有利于傷口的愈合。本研究將三組實(shí)驗(yàn)材料植入大鼠背部皮下,8周后取材。對異位成骨樣本進(jìn)行HE和Masson染色,結(jié)果顯示DBB組材料的周圍被纖維組織包裹,少量新生骨形成;CaP組的材料表面可見散在分布的新生骨;ICA-CaP組的材料表面可見多處新生骨生成。半定量分析結(jié)果表明ICA-CaP組的新生骨面積百分比顯著高于DBB組和CaP組,各組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

本研究運(yùn)用仿生磷酸鈣涂層技術(shù)將ICA負(fù)載到DBB表面的磷酸鈣涂層中,檢測改性DBB在大鼠體內(nèi)異位成骨的能力,結(jié)果顯示負(fù)載ICA的改性DBB材料具有較好的異位骨誘導(dǎo)能力,有望為臨床骨再生手術(shù)提供理想的骨替代材料。