姚秀英 劉南南 王桂清

摘要：菌核生枝頂孢霉（Acremonium sclerotigenum）作為枝頂孢屬真菌的優(yōu)勢種，其次生代謝產(chǎn)物多樣。為了明確其對植物病害致病菌的抑制效果，以桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）為靶標菌，采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法測定6種發(fā)酵液的抑菌活性。結(jié)果表明：PD培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對桃褐斑致病菌的抑制效果最好，對菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為53.673 4 mg/L和808.158 4 mg/L;培養(yǎng)5 d的PD培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌效果最好，對菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為1.445 8 mg/L和309.631 8 mg/L;菌核生枝頂孢霉發(fā)酵液對桃褐斑致病菌菌絲生長的抑制效果優(yōu)于對孢子萌發(fā)效果。該研究結(jié)果為將其開發(fā)成生物源農(nóng)藥奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菌核生枝頂孢霉;內(nèi)生菌;次生代謝物，培養(yǎng)條件;抑菌活性

中圖分類號：Q93 ? ?文獻標識碼：A ? ?文章編號：1674-1161（2019）03-0018-05

隨著人們對無污染、無公害綠色食品呼聲日益提高，生物防治成為繼農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治之后的又一種重要防治方法，許多生物殺菌劑相繼問世，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)，取得了顯著效果。植物內(nèi)生菌是微生物中非常重要的類群，其可以分泌抗生素、毒素等代謝物質(zhì)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（ISR），將其次生代謝物制成藥劑可起到生物防治作用，從而減少對生態(tài)環(huán)境的污染。植物內(nèi)生菌為抗（抑）菌活性成分的篩選開辟了新的來源，在農(nóng)業(yè)上具有非常廣闊的應(yīng)用前景。枝頂孢屬真菌（Acremonium sp.）是一種世界性分布的絲狀真菌，約有130余種，主要為腐生、植物寄生和自生，具有豐富的遺傳和生態(tài)多樣性，其次生代謝物多樣（包括萜類、酚類、環(huán)肽、蒽醌類、生物堿類等），生物活性良好，是一類能夠抑制多種植物病原真菌生長的拮抗真菌。本課題從國槐枝干中分離到一種枝頂孢屬真菌，經(jīng)形態(tài)、分子和致病性鑒定，最終確定為菌核生枝頂孢霉（A. sclerotigenum）。為了明確該內(nèi)生菌的抑菌效果，以桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）為靶標菌，采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法測定6種發(fā)酵液提取物的抑制活性，篩選出誘導(dǎo)菌核生枝頂孢霉有效次生代謝物產(chǎn)生的最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)天數(shù)，為將其開發(fā)成生物源農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種活化與培養(yǎng)

目標菌為菌核生枝頂孢霉，靶標菌為桃褐斑致病菌，均由聊城大學(xué)植物病理研究室提供，在PDA培養(yǎng)基、25±1 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5～10 d備用。

1.2 發(fā)酵液制備與提取

供試液體培養(yǎng)基包括：1） Fries培養(yǎng)基。蔗糖30.0 g，酒石酸銨5.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4NO3 1.0 g，MgSO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，結(jié)晶CaCl2 0.1 g，酵母膏1.0 g，蒸餾水1 000 mL。2） Czapek培養(yǎng)基。NaNO3 3.0 g，K2HPO4 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，蔗糖30.0 g，蒸餾水1 000 mL。3） 基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基。牛肉膏1.8 g，蛋白胨6.0 g，蒸餾水600 mL，磷酸氫二鉀0.6 g。4） 改良沙氏培養(yǎng)基。葡萄糖12.0 g，蛋白胨6.0 g，蒸餾水600 mL。5） 酵母麥芽汁葡萄糖培養(yǎng)基（YMG）。葡萄糖4.0 g，麥芽提取物10.0 g，酵母提取物4.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5±0.2。6） PD培養(yǎng)基。馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

在裝有300 mL不同液體培養(yǎng)基的錐形瓶（經(jīng)高壓滅菌）中接入直徑為0.7 cm的菌核生枝頂孢霉菌片，每瓶45個。于25±1 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)7 d，經(jīng)真空抽濾得到的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（溫度60 ℃）濃縮，直至冷凝管中無溶液滴下，得到次生代謝物粗提物。對PD培養(yǎng)基進行3，5，7，9，11 d培養(yǎng)篩選，方法如上。

粗提物用三重水溶解，配制成20 000，10 000，

5 000，2 500，1 250 mg/L的濃度梯度，用于抑菌活性測定。

1.3 抑菌活性測定方法

1.3.1 生長速率法 采用生長速率法測定不同培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對菌絲生長的抑制效果。將備用各濃度提取液與PDA培養(yǎng)基以1∶9的比例制成系列含藥培養(yǎng)基，使之終濃度為2 000，1 000，500，250，125 mg/L;接入直徑0.7 cm的靶標菌菌餅，以加入等量無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照，3次重復(fù)，于25±1 ℃，L∶D=

12∶12條件下恒溫培養(yǎng)5 d，計算抑制率。

1.3.2 孢子萌發(fā)法 采用孢子萌發(fā)法測定發(fā)酵液提取物對孢子萌發(fā)的抑制效果。將備用各濃度提取液與靶標菌孢子懸浮液按體積比1∶5混合，使之終濃度為

3 333.3，1 666.7，833.3，416.7，208.3 mg/L;凹載玻片中加入混合液10 μL，于25±1 ℃下黑暗保濕培養(yǎng)24 h，3次重復(fù)，顯微鏡下觀察孢子數(shù)及孢子萌發(fā)狀況（至少觀察100個孢子），計算孢子萌發(fā)抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計整理，經(jīng)DPSv7.05統(tǒng)計軟件進行方差分析、差異顯著性檢驗、相關(guān)系數(shù)、線性回歸等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對桃褐斑致病菌的抑制作用

2.1.1 對菌絲生長的抑制效果 培養(yǎng)7 d的6種培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對桃褐斑致病菌菌絲生長的抑制效果如圖1和表1所示。

由圖1和表1可以看出：不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對桃褐斑致病菌菌絲生長的抑制效果不同，且抑制效果均隨著發(fā)酵液濃度提高呈現(xiàn)增長趨勢，即抑制率與濃度呈線性正相關(guān)。其中，PD培養(yǎng)基發(fā)酵液對菌絲生長抑制效果最好，各濃度的抑菌效果均在55%以上，EC50為53.673 4 mg/L;Fries培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基、基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基、改良沙氏培養(yǎng)基、YMG培養(yǎng)基這5種培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌效果一般，抑制率均在26%以下，EC50均超過30 000.000 0 mg/L。

2.1.2 對孢子萌發(fā)的抑制效果 6種培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對桃褐斑致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果如圖2和表2所示。

由圖2和表2可以看出：不同培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對桃褐斑致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果趨勢與對菌絲生長的抑制效果趨勢相同。雖然PD培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對孢子萌發(fā)的抑制效果最好，但不及對菌絲生長的抑制效果，各濃度的抑制率均在25%以上，EC50為808.158 4 mg/L，是菌絲生長EC50的15.06倍，說明其對菌絲生長的抑制效果是孢子萌發(fā)的15.06倍;其他5種培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑制率均在30%以下，EC50在30 000.000 0 mg/L～170 000.000 0 mg/L之間，抑制效果較差。

綜合對菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制效果，說明PD培養(yǎng)基是誘導(dǎo)菌核生枝頂孢霉產(chǎn)生抑制桃褐斑致病菌效果最好的次生代謝物的最適培養(yǎng)基。

2.2 PD培養(yǎng)基不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液提取物對桃褐斑致病菌的抑制作用

2.2.1 對菌絲生長的抑制效果 分別培養(yǎng)3，5，7，9，11 d的PD培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對桃褐斑病菌菌絲的抑制效果如圖3和表3所示。

由圖3和表3可以看出：不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液對桃褐斑致病菌菌絲生長的抑制效果不同，且抑制效果均隨著發(fā)酵液濃度提高而增長，即抑制率與濃度呈線性正相關(guān)。其中，培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液對菌絲生長的抑制效果最好，各濃度的抑制效果均在83%以上，EC50為1.445 8 mg/L;3，7，9，11 d的抑制效果均不及5 d的抑制效果，EC50均超過6.000 0 mg/L。

2.2.2 對孢子萌發(fā)的抑制效果 不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵液提取物對桃褐斑致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果如圖4和表4所示。

由圖4和表4可以看出：除208.3 mg/L和416.7 mg/L處略低于11 d外，培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液對桃褐斑致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果總體高于其他4個時間。雖然5 d的發(fā)酵液提取物抑制效果最好，但不及對菌絲生長的效果，各濃度的抑制率均在30%以上，EC50為309.631 8 mg/L，為菌絲生長EC50的214.16倍，說明其對菌絲生長的抑制效果是孢子萌發(fā)的214.16倍;其他4個時間發(fā)酵液的EC50在315.000 0～

1 500.000 0 mg/L之間，抑制效果較差。

3 結(jié)論與討論

為了明確菌核生枝頂孢霉（Acremonium sclerotigenum）對植物病害致病菌的抑制效果，采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法測定其6種培養(yǎng)基發(fā)酵液對桃褐斑致病菌的抑菌活性，并進行培養(yǎng)時間篩選。結(jié)果表明：PD培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物活性最強，培養(yǎng)5 d的抑菌效果最好。

從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中普遍含有水分、碳源、氮源、無機鹽類和生長素，營養(yǎng)條件合適與否直接影響真菌的產(chǎn)毒及產(chǎn)生毒素的量，即影響真菌代謝產(chǎn)物的抑菌效果。PD培養(yǎng)基中的馬鈴薯浸出液含有碳源、氮源、生長物質(zhì)、礦物質(zhì)等多種微生物生長所需物質(zhì)，有助于各種霉菌生長，而Fries缺少氮源、Czapek缺少氮源和生長物質(zhì)、改良沙氏缺少礦物質(zhì)、YMG缺少氮源和礦物質(zhì)、基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基缺少碳源物質(zhì)，與PD培養(yǎng)基相比營養(yǎng)不全面。

枝頂孢屬不同菌種在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的發(fā)酵物對不同病原菌的抑菌活性不同。姚磊等人利用瓊脂平板擴散法測定枝頂孢屬真菌SC0105在小麥與YMG混合培養(yǎng)基中發(fā)酵不同天數(shù)的發(fā)酵物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性，結(jié)果表明，SC0105在小麥與YMG混合培養(yǎng)基中發(fā)酵16 d的發(fā)酵物抑菌活性最強。而本課題研究表明，菌核生枝頂孢霉（Acremonium sclerotigenum）在PD培養(yǎng)基中發(fā)酵5 d的發(fā)酵物對桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）的抑菌活性最強。

對植物內(nèi)生真菌的生物防治已有大量研究，結(jié)果表明，從植物內(nèi)生真菌中可發(fā)現(xiàn)新穎且具有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，其中某些化合物的活性較強，具有開發(fā)成為新一類抗菌藥物的潛力。菌核生枝頂孢霉作為一種內(nèi)生菌，其次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究尚少，本課題篩選誘導(dǎo)其對桃褐斑致病菌產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基和誘導(dǎo)時長，明確培養(yǎng)5 d的PD培養(yǎng)基為最適發(fā)酵條件，為將其開發(fā)成生物源農(nóng)藥奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)于菌核生枝頂孢霉的殺菌抑菌譜和作用機理等均有待于進一步探索。

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