劉瓊　于健　陳林江

【摘要】 目的 探討腦紅蛋白（NGB）在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變發(fā)展中的表達(dá)變化。方法 30只雄性SD大鼠， 隨機分為糖尿病組（DR組）和正常對照組（N組）， 每組15只。DR組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素STZ構(gòu)建糖尿病大鼠動物模型。采用原位雜交法、免疫組化、蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測NGB表達(dá)變化和分布特點。結(jié)果 誘導(dǎo)12周后， DR組大鼠體重為（309.0±11.0）kg， 明顯輕于N組的（584.1±25.4）kg， 血糖為（30.1±5.4）mmol/L， 明顯高于N組的（7.5±5.3）mmol/L， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。DR組視網(wǎng)膜組織NGB表達(dá)增加， 明顯高于N組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。原位雜交示DR組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層、光感受器層可見強陽性表達(dá)。結(jié)論 在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變發(fā)展過程中， NGB可能參與視網(wǎng)膜的神經(jīng)保護。

【關(guān)鍵詞】 腦紅蛋白;視網(wǎng)膜;糖尿病

【Abstract】 Objective To discuss the expression changes of neuroglobin （NGB） in the development of diabetic rat retinopathy. Methods A total of 30 male SD rats were randomly divided into diabetic group （DR group） and normal control group （N group）， with 15 rats in each group. In DR group， streptozotocin STZ was injected intraperitoneally to establish diabetic rat model. The expression and distribution characteristics of NGB were detected by in situ hybridization， immunohistochemistry and Western blotting. Results After 12 weeks of induction， DR group had obviously lighter rat weight as （309.0±11.0） kg than （584.1±25.4） kg in N group， and obviously higher blood glucose as （30.1±5.4） mmol/L than （7.5±5.3） mmol/L in N group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. DR group had expression of NGB in retina of increased by 55.68% compared with that of N group， and the difference was statistically significant （P<0.01）. Situ hybridization showed strong positive expression in ganglion cell layer， inner nuclear layer， outer nuclear layer and photoreceptor layer of DR group. Conclusion NGB may be involved in retinal neuroprotection during the development of diabetic rat retinopathy.

【Key words】 Neuroglobin; Retina; Diabetes

腦紅蛋白（neuroglobin， NGB）是一種主要分布于腦和視網(wǎng)膜中的特異性攜氧球蛋白， 具有儲存氧氣和促進氧氣向線粒體擴散或直接介導(dǎo)氧氣向線粒體傳遞， 促進腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的產(chǎn)生， 維持神經(jīng)元正常功能[1]。有研究表明， NGB在視網(wǎng)膜中表達(dá)遠(yuǎn)高于其他神經(jīng)組織， 其濃度約為腦內(nèi)濃度的50～100倍[2]， 而視網(wǎng)膜又是人體內(nèi)耗氧率最高的組織[3]， 這提示NGB可能與視網(wǎng)膜的氧利用密切相關(guān)。糖尿病視網(wǎng)膜病變目前成為主要的致盲疾病之一， 血糖升高導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞受損， 周細(xì)胞凋亡， 繼而引起視網(wǎng)膜血管滲漏， 視網(wǎng)膜組織水腫， 視網(wǎng)膜缺血缺氧誘發(fā)新生血管因子形成， 最終引起視網(wǎng)膜玻璃體出血導(dǎo)致患者視力嚴(yán)重受損。因此， NGB作為視網(wǎng)膜的特異性攜氧蛋白是否參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展是本研究的主要內(nèi)容。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 選取30只雄性SD大鼠（由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）， 體重200～220 g， 大鼠分籠飼養(yǎng)， 無限制標(biāo)準(zhǔn)鼠食、水飼養(yǎng)， 飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)， 室溫18～25℃， 相對濕度在50%～70%， 12 h光照晝夜循環(huán)。將30只SD大鼠隨機分為正常對照組（N組）和糖尿病組（DR組）， 每組15只。

1. 2 方法

1. 2. 1 動物模型制備 DR組大鼠禁食12 h后， 腹腔注射鏈脲佐菌素STZ（sigma 公司）60 mg/kg， 注射1 d后經(jīng)鼠尾靜脈采血檢測清晨血糖水平， 每周檢測1次， 至12周。血糖 >15 mmol/L為糖尿病大鼠模型建立成功。

1. 2. 2 免疫組化 12周后， 過量戊巴比妥腹腔注射處死大鼠， 4%多聚甲醛灌注固定后取出眼球， 4%多聚甲醛后固定2 h后， 移至30%蔗糖溶液中4℃過夜沉底， 次日常規(guī)石蠟包埋， 切片。石蠟包埋的視網(wǎng)膜組織切片常規(guī)二甲苯脫蠟， 酒精梯度脫水， 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）充分漂洗， 置入0.3%過氧化氫37℃孵育30 min， 去除內(nèi)源性過氧化氫酶活性， 0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次后， 10%正常山羊血清中室溫下孵育30 min， 滴加抗腦紅素蛋白一抗（武漢博士德公司， 1∶50）， 4℃冰箱濕盒中過夜， 次日0.01 mol/L PBS漂洗 5 min×3次， 滴加1∶1000生物素化的羊抗兔二抗（武漢博士德公司）室溫下30 min， PBS漂洗5 min×3次， 辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素室溫下孵育1 h， PBS漂洗5 min×3次， 3， 3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色3～5 min， 自來水沖洗， 貼片， 晾干， 脫水， 透明， 封片。陰性對照組：用羊血清替代一抗。

1. 2. 3 原位雜交 二甲苯脫蠟， 乙醇水化， 依次經(jīng)100%、95%、80%、75%乙醇和焦碳酸二乙酯（DEPC-H2O）各1次， 5 min/次， 0.2 mol/L 鹽酸溶液（HCL）室溫處理5 min， PBS洗片3次， 蛋白酶K（40 μg/ml）室溫下孵育20 min后， 含0.2%甘氨酸的PBS洗3次， 5 min/次， 4%多聚甲醛固定10 min后， PBS洗片2次， 醋酸干和三乙酸溶液室溫下孵育10 min， PBS洗片2次， 50℃滴加預(yù)雜交液進行預(yù)雜交2 h， 50℃過夜雜交， 檸檬酸鈉緩沖液（SSC）洗滌后， 洗膜緩沖液（TBST）洗5次后， 室溫下封閉1 h， 滴加抗地高辛一抗（1∶1000）4℃孵育過夜。TBST洗4次， 堿性磷酸酯酶顯色緩沖液（BCIP/NBT）染色液緩沖液洗2次， BCIP/NBT暗處染色24 h， TE緩沖液（pH 8.0）洗2次終止反應(yīng)， 核固紅復(fù)染5 min， 水洗殘夜， 梯度酒精脫水， 透明封片。鏡檢， 拍照。

1. 2. 4 Western blotting RIPA裂解液裂解組織提取視網(wǎng)膜織總蛋組白， 二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量后， 取各組樣本蛋白30 μg， 進行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后， 電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）， 在5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h， 加兔抗腦紅蛋白單克隆抗體（1∶1000）， β-肌動蛋白（β-actin）（1∶1000）于一抗稀釋液中， 4℃孵育過夜， TBST沖洗后， 與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）室溫下孵育2 h， 加化學(xué)發(fā)光劑曝光顯影。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 SD大鼠體重和血糖變化 誘導(dǎo)12周后， DR組大鼠體重為（309.0±11.0）kg， 明顯輕于N組的（584.1±25.4）kg， 血糖為（30.1±5.4）mmol/L， 明顯高于N組的（7.5±5.3）mmol/L， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2. 2 正常大鼠視網(wǎng)膜NGB的表達(dá) 免疫組化顯示， 正常大鼠視網(wǎng)膜組織中光感受器層， 內(nèi)、外叢狀層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見腦紅素蛋白表達(dá)。見圖2。

2. 3 原位雜交 NGB mRNA原位雜交染色的陽性物質(zhì)呈藍(lán)色， 與N組相比較， DR組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層、光感受器層可見強陽性表達(dá)， 主要為細(xì)胞質(zhì)著色。見圖3。

2. 4 糖尿病大鼠NGB的表達(dá)變化 Western blotting顯示， DR組視網(wǎng)膜NGB表達(dá)增加為（132.46±15.83）， 較N組的（84.79± 16.78）明顯增加， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖4。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)， 在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中NGB表達(dá)增加， 原位雜交顯示NGB在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層、光感受器層表達(dá)增加。

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病主要的微血管病變， 也是糖尿病致盲的首要原因。其病理改變包括微血管的改變和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的改變。持續(xù)的高血糖環(huán)境使糖尿病視網(wǎng)膜病變患者微血管發(fā)生了異常組織氧合作用從而引起微血管功能改變， 周細(xì)胞的丟失、基底膜的增厚和內(nèi)皮細(xì)胞的增生[4-8]。以上改變導(dǎo)致毛細(xì)血管完整性遭到破壞， 致使血管腔縮窄和血流改變， 促進糖尿病視網(wǎng)膜病變向后期發(fā)展， 發(fā)生毛細(xì)血管和小動脈閉塞， 導(dǎo)致視網(wǎng)膜的缺血、無灌注形成進而出現(xiàn)新生血管[9]。視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的病變與微血管病變一樣， 是糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要組成部分， 它包括神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的改變[10]。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展伴隨著視網(wǎng)膜組織缺血缺氧。

NGB是新近發(fā)現(xiàn)的第三類攜氧球蛋白， 其分子結(jié)構(gòu)與血紅蛋白和肌紅蛋白具有同源性， 主要分布在腦、視網(wǎng)膜等神經(jīng)組織， 在神經(jīng)系統(tǒng)氧的攝取、運輸和利用等生理過程中起著極其重要的作用， 體內(nèi)各處NGB表達(dá)量的增加均與組織的缺血缺氧密切相關(guān)[11]。Sun等[12]研究表明， 體外培養(yǎng)神經(jīng)元中， 低氧可誘導(dǎo)其NGB表達(dá)增高， 顯著增強細(xì)胞抗缺氧的能力， 減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷;反義核酸封閉NGB的表達(dá)， 則導(dǎo)致細(xì)胞對缺氧損傷更為敏感。視網(wǎng)膜組織作為耗氧大的組織， 其NGB的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腦組織。有研究表明， NGB除視網(wǎng)膜色素上皮和光感受器外節(jié)外， 在視網(wǎng)膜各層均有表 達(dá)[13]， 本研究也得到了相似的結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)， NGB在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層、光感受器層表達(dá)顯著增加。Chan等[14]研究發(fā)現(xiàn)， NGB轉(zhuǎn)基因鼠視網(wǎng)膜中， NGB過表達(dá)位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞， 內(nèi)外叢狀層， 光感受器內(nèi)節(jié)中， NGB轉(zhuǎn)基因鼠視網(wǎng)膜NGB過表達(dá)可以減少因急性視網(wǎng)膜缺血引起的線粒體損傷， 從而抑制細(xì)胞凋亡。也有學(xué)者認(rèn)為， NGB具有清除一氧化氮（NO）的功能， 參與NO的代謝過程， 從而減少NO對線粒體的損傷， 并且保護神經(jīng)元及細(xì)胞來抵抗氧化應(yīng)激[15]。

因此， 作者認(rèn)為， 缺氧條件下誘導(dǎo)NGB表達(dá)增加， NGB可以通過為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞提供氧， 保護線粒體功能， 減少細(xì)胞凋亡， 從而在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展過程中起到神經(jīng)保護作用。而NGB這種保護作用的機制有待進一步研究。

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[收稿日期：2019-01-15]