徐曼麗,王 暢,王 楠,何紅鵬,張同存，羅學(xué)剛

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性生存的重大疾病，據(jù)2018年美國腫瘤學(xué)會(huì)發(fā)表的GlobalCancerStatistics2018報(bào)道，在860萬女性腫瘤中，乳腺癌的新發(fā)率占到了24.2%，死亡率占15.0%，均高居第一位[1]。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)可以特異性使H3K4、H4K5、H4K20發(fā)生組蛋白甲基化[2]，并可作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，其過表達(dá)在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤[2-4]中具有關(guān)鍵的作用，此外，研究發(fā)現(xiàn)SMYD3很可能對心血管系統(tǒng)也有著重要的作用[5-6]。然而，目前對于SMYD3的功能及調(diào)控機(jī)制還并不十分清楚。

非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)是不編碼蛋白質(zhì)的RNA。人們曾認(rèn)為ncRNA不具有具體生理功能，然而隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)ncRNA在基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著十分重要的作用。其中，微小RNA(micro RNA,miRNA)是目前被研究的最多的一類ncRNA，其最為常見的作用機(jī)制是通過與目標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，導(dǎo)致目標(biāo)mRNA降解，蛋白質(zhì)的翻譯受到抑制。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：miR-124可通過直接靶向SMYD3 mRNA的3′UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制SMYD3的表達(dá)[7]。

此外，另一類倍受研究者關(guān)注的ncRNA是長度為200～1 000個(gè)核苷酸的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)[8]。lncRNA MALAT1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)又稱為NEAT2(nuclera-enriched autosomal transcript2)，屬于lncRNA家族重要成員，其不僅在血管生成過程中[9]發(fā)揮著重要作用，而且在腫瘤中也有十分重要關(guān)系。MALAT1在乳腺癌[10-11]、肝癌[12-13]、胃癌[14-15]、舌鱗癌[16]等惡性腫瘤中均呈現(xiàn)出異常的高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖[17]，影響腫瘤細(xì)胞耐藥[18]且與多種實(shí)體腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[19-20]。然而，盡管MALAT1和SMYD3都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但二者間是否存在內(nèi)在的調(diào)控關(guān)系，迄今尚屬未知。鑒于此，本課題組將對此展開分析研究。

1 材 料

1.1 試 劑

胎牛血清(天津康源生物技術(shù)有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；siRNA和miRNA mimics/inhibitor(中國Ribobio公司)；SMYD3一抗(英國Abcam公司)；GAPDH一抗(中國優(yōu)抗公司)；熒光二抗(美國Li-coR公司)；Trizol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)；SYBR GREEN染料(德國DBI公司)；青霉素、鏈霉素、胰酶、MTT及RNase A(北京索萊寶科技有限公司)。pcDNA5-TO/TAP-DEST-SMYD3質(zhì)粒由美國OSI制藥公司Kenneth W.Foreman博士饋贈(zèng)。PGL3-MALAT1-promoter質(zhì)粒由臺灣國立成功大學(xué)的Yi-Ching Wang教授饋贈(zèng)。PGL3-SMYD3啟動(dòng)子質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室自己構(gòu)建。

1.2 儀 器

ABI-Step OneTM型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)(美國Li-coR Biosciences公司)。

1.3 細(xì) 胞

人胃癌細(xì)胞系MGC-803，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和T47D均購自上海中科院，并在本實(shí)驗(yàn)室長期保存。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞系MGC-803，使用DMEM培養(yǎng)基；人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和T47D細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中均加入10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素，在飽和水蒸氣、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行37 ℃貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～90%時(shí)，采用0.25%胰酶溫和消化傳代。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

設(shè)計(jì)特異性干擾SMYD3的siRNA靶序列分別為：SMYD3-1，5′-AACATCTACCAGCTGAAGGTG-3′；SMYD3-2，5′-CAAGGATGCTGATATGCTA-3′；SMYD3-3，5′-GGAAGTTGGTGTTGGCCTA-3′。干擾MALAT1使用的是3個(gè)位點(diǎn)混合的siRNA，分別是：5′-GCCCGAGACTTCTGTAAAG-3′；5′-GCAGCCCGAGACTTCTGTA-3′；5′-GGGCTTCTCTTAACATTTA-3′。用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒：pcDNA5-TO/TAP-DEST-SMYD3、PGL3-MALAT1-promoter以及PGL3-SMYD3啟動(dòng)子質(zhì)粒。將胰蛋白酶消化的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板；次日，將孔板中換為無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用脂質(zhì)體Turbofect進(jìn)行對siRNA；pcDNA5-TO/TAP-DEST-SMYD3、PGL3-MALAT1-promoter以及PGL3-SMYD3啟動(dòng)子質(zhì)粒；micro RNA mimics或micro RNA inhibitor進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將待轉(zhuǎn)的質(zhì)?；騭iRNA和脂質(zhì)體按比例預(yù)混于無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，靜置20 min，將混合液轉(zhuǎn)移至待轉(zhuǎn)染的孔板中，并補(bǔ)充無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基至2 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，然后換成RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 MTT法

在96孔板中接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并分別在相應(yīng)時(shí)間，向每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，避光37 ℃反應(yīng)4 h后隨即棄去培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL溶解甲攢結(jié)晶。在酶標(biāo)儀中檢測490 nm波長下的吸收度。

2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-time RCR)

處理過的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入Trizol 1 mL，4 ℃ 下裂解提取RNA。取總RNA 2 μg加入M-MLV及隨機(jī)引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，隨后即可進(jìn)行PCR。PCR所用到的引物序列為：GAPDH，上游5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′；SMYD3，上游5′-CCCAGTATCTCTTTGCTCAATCAC-3′，下游5′-ACTTCCAGTGTGCCTTCAGTTC-3′；MALAT1,上游5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，下游5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′；MYL9，上游5′-CACCCACCAGAAGCCAAGAT-3′，下游5′-TGCCCTCCAGGTATTCGTCT-3′；MMP9，上游5′-GAGCACGGAGACGGGTAT-3′，下游5′-GGACCACAACTCGTCATCG-3′；CYR61，上游5′-AGCAGCGTTTCCCTTCTAC-3′，下游5′-TGAGTCCCATCACCCACA-3′。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，并以ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

2.5 免疫蛋白印跡法(Western blot)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2～3次，加入蛋白裂解液后4 ℃裂解30 min。細(xì)胞刮刀刮下皿底的細(xì)胞，收集于1.5 mL的EP管中。取蛋白裂解液40 μL加入上樣緩沖液8 μL，漩渦振蕩后置于100 ℃沸水中10 min，離心備用。上樣，蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜置于封閉液中，室溫下振蕩2 h，然后用相應(yīng)的一抗SMYD3(兔抗人單克隆抗體；稀釋度，1∶1 000)、GAPDH(小鼠抗人；稀釋度，1∶5 000)封閉過夜。隨后，將一抗棄去，PBS沖洗3次后，加入熒光二抗：山羊抗兔抗體和山羊抗鼠抗體，孵育2 h后，PBS清洗3次后，使用Odyssey掃膜儀進(jìn)行掃膜。

2.6 熒光素酶活性檢測(luciferase reporter assay)

細(xì)胞接種于24孔板中，然后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，預(yù)冷PBS清洗2～3次，每孔加入蛋白裂解液100 μL，置于冰上裂解30 min，隨后刮取細(xì)胞，取蛋白裂解液5 μL于考馬斯亮藍(lán)G-250 200 μL的透明孔板中，置于酶標(biāo)儀于595 nm檢測蛋白質(zhì)含量，在白板中加入蛋白裂解液50 μL，以及熒光底物，同樣置于酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。

2.7 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)由Graphpad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 敲低MALAT1會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移

為了探討MALAT1是否參與乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移，利用siRNA技術(shù)抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT1內(nèi)源性的表達(dá)，然后分別應(yīng)用MTT法及劃痕愈合實(shí)驗(yàn)于不同時(shí)間檢測細(xì)胞增殖和遷移情況。結(jié)果如圖1所示：相對于si-control轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染si-MALAT1的細(xì)胞劃痕愈合速度(圖1-A)更加緩慢，同樣的，在MCF-7細(xì)胞中，相對于si-control轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染si-MALAT1的細(xì)胞增殖速度也更加緩慢(圖1-B)。

After transfection with MALAT1-specific siRNAs (si-MALATI),the migration ability of cells was detected by a wound healing assay (A),and proliferation capacity was analyzed by MTT (B)

3.2 敲低MALAT1會(huì)抑制SMYD3及其下游相關(guān)基因的表達(dá)

為了探究MALAT1與SMYD3在乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的相關(guān)性，利用特異性siRNA敲低MALAT1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，然后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot的方法對MALAT1、SMYD3及其下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。siRNA特異性靶向敲除MALAT1的效率，如圖2-A所示，siRNA成功干擾MALAT1的表達(dá)；由圖2-B和2-C可以看出，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，RNAi抑制內(nèi)源性MALAT1可使SMYD3的mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)；在人胃癌細(xì)胞系MGC-803以及人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、T47D檢測SMYD3 mRNA的表達(dá)，由圖2-D所示，在MCF-7、MDA-231和T47D細(xì)胞等不同的人乳腺癌細(xì)胞系中，SMYD3均顯著高表達(dá)。除此以外，進(jìn)一步應(yīng)用熒光素酶報(bào)告分析方法檢測了在MCF-7細(xì)胞中，MALAT1的干擾對SMYD3啟動(dòng)子的影響，結(jié)果顯示：siRNA特異性干擾MALAT1后，可以使SMYD3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下熒光素酶活性呈現(xiàn)出一定程度的下調(diào)(圖2-E)，這表明MALAT1可直接對SMYD3的啟動(dòng)子產(chǎn)生一定的轉(zhuǎn)錄激活作用，但較為微弱。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示：在siRNA干擾MALAT1后，MYL9、MMP9、CYR61、N-cadherin等受到SMYD3調(diào)控的下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也均呈現(xiàn)出了顯著的下降[4,21-22]。這些結(jié)果表明SMYD3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)會(huì)受到MALAT1的調(diào)控，其中涉及到對啟動(dòng)子的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，但很可能同時(shí)還存在其他作用機(jī)制。

3.3 MALAT1作為miR-124的ceRNA調(diào)控SMYD3的表達(dá)

為了進(jìn)一步了解MALAT1對SMYD3的調(diào)控分子機(jī)制，使用生物信息學(xué)軟件starbase網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)對與MALAT1存在結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs進(jìn)行了分析預(yù)測。結(jié)果顯示：可靶向SMYD3 3′UTR對SMYD3產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用的miR-124同時(shí)也可以靶向與MALAT1結(jié)合，提示彼此間可能會(huì)存在競爭性關(guān)系(圖3-A)。進(jìn)一步的Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)：在MCF-7細(xì)胞中應(yīng)用siRNA靶向干擾MALAT1后可使miR-124的含量增加(圖3-B)，轉(zhuǎn)染miR-124模擬物可使SMYD3受到抑制，反之miR-124抑制劑則使SMYD3的表達(dá)顯著升高(圖3-C和3-D)，而將MALAT1的siRNA和miR-124 inhibitor在MCF-7細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染后，免疫蛋白印跡檢測顯示在MCF-7細(xì)胞中RNAi下調(diào)MALAT1可以明顯緩解miR-124抑制劑對SMYD3表達(dá)的促進(jìn)作用(圖3-E)。這些結(jié)果表明MALAT1可通過與SMYD3競爭miR-124的結(jié)合，從而間接調(diào)控了SMYD3的表達(dá)水平，即MALAT1可以作為miR-124的“海綿(sponge)”，以ceRNA 的形式對SMYD3表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

A:Interference efficiency of MALAT1 was detected by Real-time PCR;B,C:Protein and mRNA expression of SMYD3 were detected by Western blot and Real-time PCR;D:mRNA level of SMYD3 in breast cancer cell lines compared with gastric cancer cell MGC-803 were analyzed by Real-time PCR;E:Effect of MALAT1 interference on the luciferase activity of SMYD3-promoter reporter was detected by luciferase assay in MCF-7 cells;F:mRNA levels of MYL9,MMP9,CYR61 and N-cadherin were determined by Real-time PCR

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

A:Binding sites of miR-124/MALAT1 and SMYD3 3′UTR;B:After transfection with MALAT1-specific siRNAs,the miR-124 mRNA expression of MCF-7 ells was detected by Real-time PCR;C,D:After transfection with miR-124 mimics/inhibitor,SMYD3 expression of MCF-7 ells was detected by Western blot;E:After co-transfection of miR-124 inhibitor and MALAT1 siRNA,the protein expression level of SMYD3 was detected by Western blot

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.4 SMYD3表達(dá)可反饋激活MALAT1轉(zhuǎn)錄

很多研究發(fā)現(xiàn)，在lncRNA調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中，時(shí)常也同時(shí)存在著靶基因?qū)ncRNA的反饋式調(diào)節(jié)作用[23]。因此，本研究進(jìn)一步探討了SMYD3是否也會(huì)影響MCF-7細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)。首先，如圖4-A和4-B，SMYD3的siRNA可以成功干擾SMYD3的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR和免疫蛋白印跡分析結(jié)果顯示：相對于對照組，轉(zhuǎn)染特異性siRNA干擾SMYD3后會(huì)抑制MALAT1的轉(zhuǎn)錄水平(圖4-C)，反之，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMYD3的過表達(dá)質(zhì)粒則會(huì)引起MALAT1的顯著上調(diào)(圖4-D)。進(jìn)而，為了確定SMYD3對MALAT1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性是否存在影響，進(jìn)行了啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因活性檢測，結(jié)果顯示SMYD3的過表達(dá)可以劑量依賴性的促進(jìn)MALAT1的啟動(dòng)子活性(圖4-E)。

A,B:Interference efficiency of SMYD3 was detected by Real-time PCR;C,D:Effect SMYD3 overexpression and knockdown on MALAT1 mRNA level;E:Effect of SMYD3 overexpression on the luciferase activity of MALAT1-promoter reporter was detected by luciferase assay in MCF-7 cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

4 討 論

表觀遺傳是指在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致了表型的變化。其中包括DNA修飾、ncRNA調(diào)控、組蛋白修飾等。目前發(fā)現(xiàn)，不同的表觀遺傳修飾之間存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的彼此調(diào)控關(guān)系。其中非編碼RNA調(diào)控是通過某些機(jī)制實(shí)現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，例如miRNA可以通過結(jié)合靶基因mRNA導(dǎo)致基因沉默，而lncRNA可以通過競爭性地結(jié)合microRNA，以ceRNA的形式來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[24-25]。

lncRNA MALAT1廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物正常組織，并在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中異常表達(dá)，雖然MALAT1不直接編碼蛋白，但其對腫瘤的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移以及耐藥等都有不同程度的影響，發(fā)揮重要作用。如，MALAT1的內(nèi)源性缺失可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移[26]。hsa-miR-125b可以通過下調(diào)MALAT1的表達(dá)而抑制膀胱癌的發(fā)展[27]。MALAT1作為miR-106b-5p的ceRNA通過SLAIN2增強(qiáng)微管移動(dòng)性促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。在口腔鱗癌中，MALAT1可能通過調(diào)控EMT促進(jìn)的增殖和侵襲過程[28]。在三陰性乳腺癌中MALAT1通過靶向miR-129-5p促進(jìn)增殖和侵襲。異常表達(dá)的KDM5B通過MALAT1過表達(dá)和下調(diào)hsa-miR-448來促進(jìn)侵襲性乳腺癌[29]。MALAT1通過競爭性結(jié)合miR-1調(diào)節(jié)cdc42表達(dá)來誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[30]。在本研究中顯示RNAi抑制MALAT1后使乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231增殖和遷移能力的受到抑制，同時(shí)研究中也發(fā)現(xiàn)siRNA靶向干擾MALAT1后使SMYD3的mRNA和蛋白質(zhì)水平也受到了抑制，且值得注意的是，MALAT1與SMYD3之間的調(diào)控關(guān)系未見報(bào)道。

SMYD3已被證實(shí)在乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤癌組織中都有異常的高表達(dá)，而在相應(yīng)的正常組織中表達(dá)量低[2]，這與腫瘤患者的存活率密切相關(guān)[3]。并且本課題組研究發(fā)現(xiàn)[32-33]，干擾SMYD3可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖與遷移；SMYD3的過表達(dá)可上調(diào)遷移基因MYL9，與MRTF-A協(xié)同促進(jìn)乳腺癌發(fā)生遷移[4]。SMYD3通過金屬蛋白酶MMP9的表觀遺傳上調(diào)促進(jìn)腫瘤侵襲[21]。miR-200c可能是乳腺癌細(xì)胞遷移過程中SMYD3介導(dǎo)通路的下游負(fù)調(diào)控因子[34]。除此以外，SMYD3可以促進(jìn)乳腺癌的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[22]。由此可見，SMYD3已被視為是非常有潛力的腫瘤基因治療及藥物研發(fā)新靶點(diǎn)之一。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，MALAT1 siRNA特異性干擾MALAT1后，使受SMYD3調(diào)控的下游相關(guān)基因(如:EMT標(biāo)志基因N-cadherin、遷移基因MYL9、金屬蛋白酶MMP9等)的表達(dá)也發(fā)生了下調(diào)。

研究表明，miR-124可通過下調(diào)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞中SMYD3的表達(dá)來抑制遷移和侵襲[7]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中RNAi抑制MALAT1后促進(jìn)了miR-124基因水平的表達(dá)，miR-124也會(huì)影響SMYD3的表達(dá)，且miR-124抑制劑對SMYD3的促進(jìn)作用可因MALAT1的抑制而減弱，說明MALAT1可能介導(dǎo)其中，除此以外，本研究也發(fā)現(xiàn)SMYD3可反饋激活MALAT1轉(zhuǎn)錄，這提示SMYD3、MALAT1、miR-124三者之間很可能會(huì)通過這種反饋式的惡性循環(huán)調(diào)節(jié)方式，加劇乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程。本研究為乳腺癌的防治提供了一些新的思路。