倪曉彬， 蔡志雄， 李和慨， 易敏

1汕頭市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科(廣東汕頭 515031)； 2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院心臟中心(廣東廣州 510280)

心肌梗死是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)移植治療心肌梗死很有發(fā)展及應(yīng)用前景，但臨床試驗的結(jié)果顯示這種細胞移植的方法對心肌梗死的治療效果不太理想，其主要原因之一是移植到梗死局部區(qū)域的MSC存活及滯留率低[2-4]。要使MSC移植發(fā)揮對心肌梗死更好的治療作用必須改善MSC在梗死局部區(qū)域的存活及滯留率。Bcl-2是調(diào)控細胞存活和凋亡的重要基因[5-6]。VEGF是重要的促血管生成細胞因子，VEGF對增強心肌梗死后心臟局部血管新生和改善心功能的作用已得到證實[7]。在之前的研究中我們成功構(gòu)建了VEGF和Bcl-2雙基因修飾的MSC，體外實驗結(jié)果證實其在糖氧剝奪環(huán)境下能更強旁分泌多種細胞因子[8]。2016年10月至2017年3月，我們將VEGF和Bcl-2雙基因修飾的MSC與新生SD大鼠心肌細胞共培養(yǎng)并缺氧處理24 h，研究其是否能減少缺氧心肌細胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠MSC購自中國Cyagen公司；VEGF和Bcl-2雙基因修飾的MSC(MSC+BV)為本實驗室之前所構(gòu)建并保存[8]；出生1～3 d的新生SD大鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 胎牛血清、胰蛋白酶、PBS(Invitrogen)，DMEM、青霉素-鏈霉素(Gibco)，DAPI染色液(Sigma)，TUNEL染色試劑盒(Roche)、Annexin V-FITC/PI試劑盒(eBioscience)。

1.2.2 主要儀器 超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、三氣培養(yǎng)箱(Thermo)，熒光顯微鏡(NIKON)，高壓消毒滅菌鍋(Astell)，倒置相差顯微鏡(Leika)，BD Accuri C6流式細胞儀(BD)，Transwell嵌套培養(yǎng)六孔板(Coring，貨號：CNG3412)。

1.3 新生SD大鼠心肌細胞分離與培養(yǎng) 使用出生1～3 d的新生SD大鼠，在胸骨左緣用小剪刀剪開皮膚和肋骨后用鑷子將心臟整體離斷夾出并放到D-Hanks 液皿中清洗，離體心臟清洗后置于加入 0.25% EDTA 胰酶的培養(yǎng)瓶中，4℃消化過夜，加入DMEM培養(yǎng)液放置至37℃水浴箱5 min以中止胰酶消化，棄上清液后加膠原酶消化液(D-Hanks液50 mL+牛血清白蛋白500 mg +Ⅱ型膠原酶40 mg)，放置至37℃水浴箱1 min后棄上清液，將消化后的心臟組織移至有磁珠的培養(yǎng)瓶，加入膠原酶消化液在37℃攪拌20 min后將液體移到15 mL離心管，800 r/min離心3 min，棄上清，用含血清的DMEM反復(fù)吹打混勻，移至細胞培養(yǎng)皿，在37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min。取出培養(yǎng)皿，在超凈工作臺內(nèi)將細胞懸液吸出，混勻后移入新的皿中，再次放于箱中培養(yǎng)，每天換液，第7天可處理細胞。

1.4 心肌細胞與MSC的缺氧共培養(yǎng) 使用Transwell嵌套共培養(yǎng)系統(tǒng)， 0.4 μm的嵌套膜孔徑使得細胞不能通過，僅允許培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)及細胞因子進行交換，其示意圖見圖1。

圖1 Transwell嵌套共培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖

將凍存的MSC及MSC+BV細胞復(fù)蘇，接種至T25培養(yǎng)瓶放至培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第2天在其生長至80%融合時消化并將其按1×105的數(shù)量接種至Transwell嵌套多孔膜上。將心肌細胞以1×105的數(shù)量接種至六孔Transwell共培養(yǎng)板上，正常培養(yǎng)48 h。將接種有MSC或MSC+BV的Transwell嵌套置于接種有心肌細胞的六孔培養(yǎng)板上面，加入含10%FBS的DMEM，置于培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)24 h后更換無血清的DMEM并置于三氣培養(yǎng)箱中(94%N2、5%CO2、1%O2)培養(yǎng)24 h。實驗分組：正常培養(yǎng)組、缺氧培養(yǎng)組、與MSC共培養(yǎng)缺氧組、與MSC+BV共培養(yǎng)缺氧組。

1.5 TUNEL染色檢測缺氧狀態(tài)下與MSC共培養(yǎng)的心肌細胞凋亡 在Transwell六孔板置入無菌細胞爬片后按1.4描述的方法進行心肌細胞與MSC或MSC+BV的缺氧共培養(yǎng)，按試劑盒說明書進行TUNEL染色操作。

1.6 Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測缺氧狀態(tài)下與MSC共培養(yǎng)的心肌細胞凋亡 按1.4描述的方法進行細胞共培養(yǎng)及缺氧處理后將心肌細胞按試劑盒說明書操作立即行Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測凋亡。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩組間比較用t檢驗,多組比較采用ANOVE方差分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生SD大鼠心肌細胞培養(yǎng)后形態(tài) 最初分離的心肌細胞呈球型，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后開始貼壁生長，12 h后幾乎全部貼壁，細胞呈三角形或者多邊形。心肌細胞一開始即有頻率為40～60次/min的搏動，48 h后搏動的頻率為80～100次/min，搏動趨向同步性。細胞形成單層細胞或者相互交織形成細胞簇。見圖2。

圖2 新生SD大鼠心肌細胞的鏡下觀察(光鏡下×400)

2.2 TUNEL染色法 熒光顯微鏡下觀察TUNEL染色的心肌細胞，藍色為DAPI染色的存活的心肌細胞核，綠色為凋亡的心肌細胞核。TUNEL染色結(jié)果：正常培養(yǎng)組心肌細胞凋亡率為(9.1±1.6)%，缺氧培養(yǎng)組心肌細胞凋亡率為(36.8±1.4)%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與MSC共培養(yǎng)缺氧組心肌細胞凋亡率為(28.7±1.6)%，與缺氧培養(yǎng)組心肌細胞凋亡率比較，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與MSC+BV共培養(yǎng)缺氧組心肌細胞凋亡率為(16.3±2.7)%，與與MSC共培養(yǎng)缺氧組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 熒光顯微鏡下TUNEL染色檢測與MSC缺氧共培養(yǎng)的心肌細胞凋亡(TUNEL染色，×400)

2.3 Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù) 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果為：正常培養(yǎng)組心肌細胞凋亡率為(7.6±2.1)%，缺氧培養(yǎng)組心肌細胞凋亡率為(34.7±3.3)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與MSC共培養(yǎng)缺氧組心肌細胞凋亡率為(28.2±1.3)%，與缺氧培養(yǎng)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與MSC+BV共培養(yǎng)缺氧組心肌細胞凋亡率為(14.2±1.7)%，與與MSC共培養(yǎng)缺氧組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測與MSC缺氧共培養(yǎng)的心肌細胞凋亡

3 討論

MSC不單具有向多種細胞分化的能力，也能通過旁分泌效應(yīng)分泌多種類的細胞因子。MSC分化為心肌細胞和旁分泌效應(yīng)是MSC移植能治療心肌梗死起治療作用的主要機制[9-11]。MSC 可旁分泌多種細胞因子和蛋白質(zhì)[12]，主要分有以下分類[13]：(1)生長因子，比如血管內(nèi)皮生長因子和成纖維細胞生長因子等；(2)干細胞特異性活性因子，如干細胞衍生因子等；(3)化學(xué)趨化因子，比如巨噬細胞集落刺激因子、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白和單核細胞化學(xué)誘導(dǎo)蛋白-1等；(4)調(diào)節(jié)肽，如腦鈉素、心鈉素、降鈣素基因相關(guān)肽和降鈣素等。在之前的研究[8]中，我們已經(jīng)證實VEGF和Bcl-2雙基因修飾能增強MSC在糖氧剝奪環(huán)境下旁分泌HGF、bFGF、IGF-1和VEGF這4種細胞因子。在本研究中我們分別將新生SD大鼠心肌細胞與VEGF和Bcl-2雙基因修飾的MSC以及未經(jīng)基因修飾的MSC用Transwell嵌套缺氧共培養(yǎng)的方法來研究VEGF和Bcl-2雙基因修飾的MSC是否通過旁分泌效應(yīng)減少缺氧心肌細胞的凋亡。TUNEL染色及Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)兩種凋亡檢測方法的結(jié)果均表明缺氧處理增加了心肌細胞凋亡，與未經(jīng)基因修飾的MSC共培養(yǎng)能減少缺氧心肌細胞凋亡，而與VEGF和Bcl-2雙基因修飾的MSC共培養(yǎng)的缺氧心肌細胞凋亡則進一步減少。這說明VEGF和Bcl-2雙基因修飾的MSC對比普通MSC更能減少缺氧心肌細胞凋亡。采用共培養(yǎng)的實驗方式表明，VEGF和Bcl-2雙基因修飾的MSC減少缺氧心肌細胞凋亡的作用來自于增強的MSC的旁分泌效應(yīng)。

綜上所述，VEGF和Bcl-2雙基因修飾MSC可以通過旁分泌效應(yīng)減少缺氧心肌細胞凋亡，這對基因修飾MSC策略改善細胞移植對心肌梗死治療效果提供了新的思路。