牟登峰,鄭 丹,王 琪,黃仕美,官志忠,于燕妮,樓迪棟

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室；2. 貴陽婦幼保健院圍產(chǎn)期保健科；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)屬于苯丙胺類神經(jīng)興奮劑(amphetamine-typed stimulant，ATS)，俗稱“冰毒”，它具有藥物依賴、中樞神經(jīng)興奮性、致幻、食欲抑制和擬交感效應(yīng)等藥理、毒理學(xué)特性[1]。目前，METH的神經(jīng)毒性作用的損傷學(xué)說主要有以下幾種：神經(jīng)元凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂等[2-4]。其中，線粒體功能及凋亡通路與METH的致病機(jī)制越來越受到學(xué)者關(guān)注。有研究認(rèn)為，線粒體分裂過度或融合不足都會(huì)導(dǎo)致線粒體碎裂，降低呼吸作用和能量生產(chǎn)，增加神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡的可能性[5]。線粒體分裂蛋白1(Fission 1，F(xiàn)is1)的過度表達(dá)可以導(dǎo)致線粒體分裂，造成線粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，藥物抑制分裂可以減輕細(xì)胞凋亡[6]。在METH研究中，蔣雷等[7]發(fā)現(xiàn)，METH處理后，短時(shí)間內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)下降，膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道異常開放，Bax水平上調(diào)，繼而激活caspase-3凋亡蛋白，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。目前，有越來越多的研究者關(guān)注METH致神經(jīng)細(xì)胞毒性與線粒體功能紊亂之間的關(guān)系，但相關(guān)機(jī)制還未闡明。本實(shí)驗(yàn)擬通過METH作用于體外培養(yǎng)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(human neuroblastoma cells，SH-SY5Y cells)，觀察MMP水平、線粒體超微結(jié)構(gòu)及線粒體融合蛋白1(mitofusion 1，Mfn1)和Fis1蛋白表達(dá)水平，探索線粒體在METH致體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 試劑與儀器METH(美國(guó)Cerilliant公司，標(biāo)準(zhǔn)品編號(hào)：M-009，純度：99.9%)；胎牛血清(FBS，美國(guó)BI公司)；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(東仁化學(xué)科技有限公司)；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(上海碧云天公司)；兔抗人Mfn1單克隆抗體、兔抗人Fis1單克隆抗體(美國(guó)Abmart公司)；兔抗人β-actin抗體(美國(guó)Gene Tex公司)。恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；ELX800UV酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；DMi8型倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；H-7650型透射電鏡(日本Hitachi公司)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖將體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按1×104/孔的密度接種于96孔板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，換含有METH(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol·L-1)的培養(yǎng)液培養(yǎng)，時(shí)間為3、6、12、24 h，每組3個(gè)復(fù)孔。向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%，取細(xì)胞存活率較高的METH處理組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用成組設(shè)計(jì)，在含SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入不同濃度的METH(0.0、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1)，濃度的選擇參照文獻(xiàn)[8]以及CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)時(shí)間分別為3、6、12、24 h。

1.4 JC-1法檢測(cè)MMP按照試劑盒說明書操作。使用倒置熒光顯微鏡觀察METH處理SH-SY5Y細(xì)胞3、6、12、24 h后的各組細(xì)胞的紅、綠熒光，計(jì)算機(jī)采集熒光圖像，使用Image J軟件重疊紅綠熒光，將合成熒光的光密度比值作為膜電位表達(dá)水平值。

1.5 透射電鏡觀察SH-SY5Y細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)收集細(xì)胞；將細(xì)胞固定于2.5%戊二醛溶液中4 h(4 ℃)，0.1 mol·L-1PBS漂洗；1%鋨酸溶液后固定2 h(4 ℃)，0.1 mol·L-1PBS漂洗；丙酮脫水；Epon812樹脂包埋；切片；醋酸鈾、硝酸鉛染色；上機(jī)觀察。

1.6 Western blot法檢測(cè)Mfn1和Fis1蛋白表達(dá)水平收集METH處理SH-SY5Y細(xì)胞3、6、12、24 h后的各組樣本，使用RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各樣本蛋白濃度。經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉2 h后，使用Mfn1(1 ∶1 500)、Fis1(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶5 000)一抗4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1 h。將PVDF膜與超敏發(fā)光液(ECL)試劑反應(yīng)1 min后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描PVDF膜，Image J軟件分析Mfn1和Fis1蛋白條帶，使用β-actin蛋白條帶校正。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果如Fig 1所示，使用不同濃度的METH處理SH-SY5Y細(xì)胞3、6、12、24 h后，METH抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖，SH-SY5Y細(xì)胞存活率隨METH濃度和作用時(shí)間的增加而減小。由于METH濃度>2.0 mmol·L-1時(shí)，對(duì)應(yīng)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率較小，故選取1.0、1.5、2.0 mmol·L-1METH處理組作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

Fig 1 Effect of METH on survival rate of SH-SY5Y

2.2 SH-SY5Y細(xì)胞MMP水平Tab 1結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各METH處理組MMP紅、綠熒光比值呈明顯降低趨勢(shì)。在熒光顯微鏡下，紅色熒光除個(gè)別細(xì)胞較強(qiáng)外，隨METH濃度升高主要呈下降趨勢(shì)；綠色熒光強(qiáng)度隨METH濃度升高主要呈上升趨勢(shì)(Fig 2)。

Fig 2 MMP in SH-SY5Y cells cultured in vitro detected by the red-green overlapping fluorescence(×400)

Green arrows indicate the normal MMP, while red arrows indicate the decreased MMP.

2.3 METH對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響如Fig 3所示，透射電鏡下觀察對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體呈橢圓形棒狀雙層膜結(jié)構(gòu)，線粒體嵴正常、清晰；低METH組(1.0 mmol·L-1)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜結(jié)構(gòu)尚完整，部分嵴出現(xiàn)腫脹及斷裂；高M(jìn)ETH組(2.0 mmol·L-1)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體內(nèi)外膜可見破損，線粒體嵴扭曲變形且大量減少或消失，部分空泡化；低、高M(jìn)ETH組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體橢圓形棒狀結(jié)構(gòu)減少，小球狀結(jié)構(gòu)隨之增加。此外，高M(jìn)ETH組發(fā)現(xiàn)典型的線粒體自噬過程(Fig 4)。

Tab 1 MMP red-green overlapping fluorescence ratio of SH-SY5Y cells cultured in vitro between control group and METH treatment

*P<0.05vscontrol

Fig 3 Observation of mitochondrial ultrastructure of SH-SY5Y cells by TEM(×4 000)

A: Control group, mitochondria elliptical rod-like structure, normal and clear; B: Low METH group, the mitochondrial elliptical structure splitting into a small spherical structure(arrows); C: High METH group, the mitochondrial globular structure significantly increased(arrows). M: mitochondria; N: nuclei.

Fig 4 Observation of mitochondrial autophagy in SH-SY5Y cells treated with 2.0 mmol·L-1 METH by TEM(A,B: ×8 000; C: ×7 000)

A: Phagocytic vacuoles(arrows) of a nearly spherical double-layered lipid structure, lysosomes of single-layer structure(shown by double arrows); B: Phagocytic vesicles envelop the mitochondria to form mitochondrial autophagy bodies(arrows);C: The lysosome and the autophagosome fuse to form a single-layer structure of autophagosomes(arrows), and the autolysosomal lysosome encapsulates the substance to be dissolved. The substance to be decomposed is deep in degradation, and the substance morphology is difficult to distinguish. M: mitochondria; ER: endoplasmic reticulum.

2.4 METH對(duì)Mfn1蛋白表達(dá)的影響如Fig 5所示，與對(duì)照組比較，METH作用SH-SY5Y細(xì)胞3、12、24 h時(shí)，Mfn1蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；與對(duì)照組比較，METH作用SH-SY5Y細(xì)胞6 h時(shí)，METH(1.5、2.0 mmol·L-1)處理組Mfn1蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)。相同時(shí)間內(nèi)，隨著METH濃度的升高，Mfn1蛋白表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)；與相同濃度的METH處理3 h比較，處理12 h時(shí)Mfn1蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)。

Fig 5 Expression of Mfn1 protein in SH-SY5Y

*P<0.05vscontrol

2.5 METH對(duì)Fis1蛋白表達(dá)的影響如Fig 6所示，與對(duì)照組比較，METH作用SH-SY5Y細(xì)胞3、24 h時(shí)，F(xiàn)is1蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與對(duì)照組比較，METH作用SH-SY5Y細(xì)胞6、12 h時(shí)，METH(1.5、2.0 mmol·L-1)處理組Fis1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。相同時(shí)間內(nèi)，隨著METH濃度的升高，F(xiàn)is1蛋白表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)；與相同濃度的METH處理3 h比較，處理24 h時(shí)Fis1蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)。

Fig 6 Expression of Fis1 protein in SH-SY5Y

*P<0.05vscontrol

3 討論

METH具有極強(qiáng)的精神興奮和致幻作用，長(zhǎng)期濫用者甚至?xí)霈F(xiàn)精神障礙，METH的致病機(jī)制急待探明。研究認(rèn)為，METH的離子化學(xué)特性可改變電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)電化學(xué)梯度，可影響ATP酶的活性和線粒體膜的完整性[9]。但線粒體形態(tài)及功能在METH致神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用仍未闡明。本研究擬通過METH處理SH-SY5Y細(xì)胞，觀察線粒體融合與分裂功能及其相應(yīng)的形態(tài)學(xué)改變，觀察線粒體在其發(fā)病機(jī)制中的作用。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)METH處理后，MMP降低，且與METH的濃度和作用時(shí)間有依賴性。而MMP下降是細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期標(biāo)志[10]，可能是我們實(shí)驗(yàn)中METH致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的早期信號(hào)。我們推測(cè)，當(dāng)線粒體受到METH作用時(shí)，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)持續(xù)開放，允許小分子通過，使膜兩側(cè)的離子梯度改變，導(dǎo)致線粒體膜電位下降[11-12]，并且允許線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[13]。

同時(shí)研究認(rèn)為，MMP改變會(huì)引起細(xì)胞線粒體形態(tài)改變。其形態(tài)調(diào)節(jié)受線粒體動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白控制，分別為線粒體融合蛋白和分裂蛋白，其中Mfn1和Fis1是主要蛋白，此過程稱為線粒體動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)[14-15]，是保證膜結(jié)構(gòu)完整的重要條件，也是維持正常膜電位，防止細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。我們觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組線粒體超微結(jié)構(gòu)正常；而METH處理組細(xì)胞線粒體呈小球狀結(jié)構(gòu)，線粒體內(nèi)外膜破損、嵴破壞，出現(xiàn)吞噬清除損傷的線粒體現(xiàn)象。Twig等[16]認(rèn)為，線粒體分裂產(chǎn)生兩個(gè)不均勻的小體，健康膜部分有較高的膜電位，可再融合；受損膜部分膜電位較低，易被自噬體吞噬。本實(shí)驗(yàn)METH處理細(xì)胞表現(xiàn)與Twig等的研究結(jié)果基本一致。我們認(rèn)為METH處理后，細(xì)胞內(nèi)的MMP下降，啟動(dòng)線粒體分裂，將膜電位較低部分分裂清除，啟動(dòng)自噬。為進(jìn)一步證明我們的推測(cè)，我們同時(shí)檢測(cè)了Mfn1和Fis1蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在SH-SY5Y細(xì)胞中，Mfn1蛋白表達(dá)量下降，F(xiàn)is1蛋白表達(dá)量上升,且與METH處理時(shí)間和濃度相關(guān)，表明Mfn1和Fis1蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)趨勢(shì)與METH致細(xì)胞MMP下降及分裂現(xiàn)象相一致。這再次證實(shí)前面的推測(cè)。

綜上所述，過量METH可能通過影響線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或線粒體膜，致體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞MMP下降，線粒體趨向分裂，啟動(dòng)自噬和細(xì)胞凋亡；線粒體功能紊亂是METH致神經(jīng)毒性的重要機(jī)制之一。