張曉紅，王寒濤，王聰聰，張芳芳，鄧 妍，魏恒玲，胡根海

(1.河南科技學院 生命科技學院，現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.中國農(nóng)業(yè)科學院 棉花研究所，棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000)

棉花是我國重要的纖維作物及經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中具有舉足輕重的戰(zhàn)略地位。目前，我國棉花在向新疆轉(zhuǎn)移的大形勢下，早熟作為育種的重要目標性狀顯得尤為重要[1]。適時開花是早熟棉培育的一個重要指標，也是棉花能否獲得豐產(chǎn)的重要農(nóng)藝性狀之一[2]。分析花發(fā)育相關基因，對棉花品種熟期改良及實現(xiàn)棉花機械化采收具有重要意義。

磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)在自然界廣泛分布。在動物方面的研究表明，PEBP蛋白參與MAPK/ERK信號通路調(diào)節(jié)細胞分化、遷移和黏附，參與NF-κB 信號通路調(diào)節(jié)細胞凋亡，參與GPCR 信號通路調(diào)控G 蛋白的信號轉(zhuǎn)導等[3-5]。植物中PEBP蛋白主要參與開花調(diào)控通路、植株形態(tài)構建和ABA誘導的種子萌發(fā)信號等途徑[6-8]。植物中TFL1(Terminal flower1)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白中的1個亞組，該亞組基因的功能大部分集中在開花調(diào)控通路。擬南芥中TFL1通過維持莖頂端分生組織和花序分生組織的無限性，延長植株的營養(yǎng)生長過程，從而延遲植株的生殖生長進程[9]。Conti等[10]研究表明，TFL1蛋白能通過運輸?shù)竭_頂芽，并且調(diào)控擬南芥的植株結(jié)構，TFL1蛋白還能抑制AP1和LFY基因的表達并且保持花序的無限生長。對TFL1基因啟動子結(jié)構的研究發(fā)現(xiàn)，該基因通過在營養(yǎng)器官的分生組織中表達來控制開花時間[11]。Liu等[12]在山茱萸中發(fā)現(xiàn)，ClTFL1過表達轉(zhuǎn)化擬南芥后，擬南芥開花時間推遲，植株高度增加，頂端花芽和次生花序分枝增多。水稻中TFL1同源蛋白質(zhì)RCN與Hd3a競爭是通過與14-3-3蛋白結(jié)合調(diào)控花發(fā)育[13]。棉花中GhTFL1基因與果枝形成發(fā)育相關[14-15]。

本研究依據(jù)棉花基因組測序結(jié)果[16-17]，以棉花品種中棉所36為材料，克隆GhTFL1b基因，進行組織特異性、激素和脅迫處理，分析其表達模式，對GhTFL1亞組與GhFD進行互作分析，旨在摸清GhTFL1b表達調(diào)控的分子機制，從而為棉花早熟分子改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用棉花材料包括栽培種和半野生種，栽培種為中棉所36，半野生種為尖斑棉。DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、pMD18-T載體、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒購自天根公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自康為世紀公司；pBI121載體及根癌農(nóng)桿菌LBA4404由河南科技學院棉花基因工程實驗室制備并保存。

1.2 材料處理及取樣

用于光照試驗的材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所早熟組人工氣候培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件為長日照。二葉展平時期，短日照處理7 d，并將處理過后的棉花分2批繼續(xù)培養(yǎng)，1批為長日照，光照/黑暗為14 h/10 h，光照時間為8：00-22：00；另一批為短日照，光照/黑暗為10 h/14 h，光照時間為8：00-18：00，溫度均為28 ℃，子葉展平期到五葉展平期取樣，取樣后快速放入液氮中冷凍，并于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用棉花水培法來研究GhTFL1b在激素(赤霉素、脫落酸和水楊酸)和鹽脅迫(NaCl)處理下的應答模式。所用材料為中棉所36水培苗，室內(nèi)種植條件為14 h光照/10 h黑暗，溫度為26 ℃。于三葉期水培液中增加激素和脅迫處理，以清水為對照。所用水楊酸(Salicylic acid，SA)濃度為200 μmol/L，脫落酸(Abscisic acid，ABA)和赤霉素(Gibberellins，GA)濃度為100 μmol/L，分別于處理后1，3，7，12，24 h進行根部取樣，選取10株左右水培苗剪下幼嫩根部，吸取根部水分后液氮冷凍，并于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫囼炛貜?次，利用GraphPad Prism 5軟件進行作圖及統(tǒng)計分析。

1.3 生物信息學分析

研究中所用到的氨基酸序列下載自NCBI網(wǎng)站，使用ClustalX2軟件進行多重序列比對，使用MEGA 6.06最大似然方法構建進化樹。利用Compute pI/Mw(http：//web.expasy.org/compute_pi/)對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行預測和分析，并用CDD(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)數(shù)據(jù)庫對其結(jié)構域進行預測。采用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測啟動子區(qū)域順式作用元件。

1.4 基因定量表達分析

使用天根多糖多酚RNA提取試劑盒提取RNA，所使用RNA的質(zhì)量必須保證OD260/280為1.8～2.1，OD260/230大于1.8。使用TaKaRa RR047A試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，使用gDNA Eraser消化總RNA中殘留的基因組DNA，進行15 min的反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。使用SYBR Green分析法進行熒光定量，所用試劑盒為TaKaRa RR420A，所用儀器為Applied Biosystems Q6實時熒光定量PCR儀。棉花中以ACTIN為內(nèi)參，所用引物見表1。

1.5 重組載體構建和酵母轉(zhuǎn)化

載體pGBKT7、pGADT7以及菌株Y2H和 Y187購自Clontech。以cDNA為模板，通過特異性Infusion引物擴增FD和GhTFL1亞組基因在棉花中的CDS，所用引物見表1。利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SacⅠ雙酶切載體pGADT7，利用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切載體pGBKT7，形成黏性末端，利用Infusion連接試劑盒進行連接。將連接后的新鮮菌液送金唯智生物科技有限公司測序，并保存測序正確的單克隆菌液以供后續(xù)試驗使用。參考Zhang等[18]的方法進行酵母轉(zhuǎn)化和酵母雙雜交試驗。

表1 棉花GhTFL1b基因克隆及 表達所用引物(GhTFL1a、GhTFL1c、GhTFL1d)Tab.1 Primers used in GhTFL1b gene cloning and expression in upland cotton

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花GhTFL1b基因的序列分析

棉花GhTFL1亞組中有4個基因，分別是GhTFL1a、GhTFL1b、GhTFL1c和GhTFL1d。GhTFL1b基因位于棉花A亞組第11號染色體上，編碼框長519 bp，編碼172氨基酸。經(jīng)理化性質(zhì)預測可知，其編碼蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為19.6 ku，等電點為9.41。進化樹分析結(jié)果表明，棉花GhTFL1b與擬南芥AtTFL1親緣關系相近(圖1-A)。根據(jù)TAIR網(wǎng)站(http：//www.arabidopsis.org/)提供的擬南芥TFL1氨基酸序列進行序列比對，該氨基酸序列具有比較保守的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白結(jié)構域(圖1-B)。

A.進化樹分析；B.氨基酸多重序列比對；*代表氨基酸完全一致，AtBFT、AtTFL1、AtATC序列號分別為NM_125597、U77674、NM_128315。A.Phylogenetic analysis of GhTFL1 and their homologous genes in Arabidopsis; B.Alignment of amino acid sequences of GhTFL1b and their homologous genes in Arabidopsis; *indicated the same amino acid，the ID of AtBFT，AtTFL1 and AtATC is NM_125597，U77674 and NM_128315，respectively.

2.2 GhTFL1b基因的表達分析

對GhTFL1b基因進行組織表達特異性分析表明，該基因在花中表達量最高，其次是頂芽和根(圖2)。為研究GhTFL1b是否受光周期影響，利用光周期試驗處理半野生種和栽培種材料，對不同時期幼苗葉片取樣分析(圖3)。結(jié)果表明，GhTFL1b在半

圖2 棉花GhTFL1b組織特異性表達Fig.2 Organ-specific expression of GhTFL1b in cotton

野生種和栽培種中表達量無明顯變化趨勢。該結(jié)果說明，GhTFL1b基因在花中優(yōu)勢表達，而且從半野生種到栽培種的進化過程中，GhTFL1b對不同光照條件變化趨勢不敏感。

圖3 棉花GhTFL1b在栽培種和半野生種中表達模式Fig.3 Expression patterns of GhTFL1b genes in cultivated cotton and semi-wild cotton

2.3 GhTFL1b啟動子分析及其對外源激素的應答

GhTFL1b基因擁有磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白的保守結(jié)構域，因此分析啟動子的順式作用元件對于揭示GhTFL1b的功能非常必要。從中棉所棉花基因組數(shù)據(jù)庫中獲取GhTFL1b基因起始密碼子上游2 000 bp的序列，并利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對其順式作用元件進行預測。結(jié)果如表2所示，該基因的啟動子主要存在2大類順式作用元件，一類是光響應元件和生物鐘節(jié)律響應元件，一類是脅迫響應元件，如與脅迫相關的茉莉酸、脫落酸和干旱脅迫等元件，表明GhTFL1b的表達可能受光、生物鐘、逆境及植物激素等的調(diào)控。

表2 棉花GhTFL1b啟動子順式作用元件預測Tab.2 The predicted cis-acting elements of GhTFL1b promoter in cotton

脅迫響應24 h內(nèi)GhTFL1b表達量變化如圖4。經(jīng)SA處理3 h后GhTFL1b的表達量開始下降，7 h降到最低值(圖4-A)。經(jīng)ABA處理(圖4-B)1 h后GhTFL1b表達量開始下降，到3 h達到最小值，隨后開始上升。經(jīng)GA處理后(圖4-C)，GhTFL1b的表達量與對照相比，在3 h達到峰值，隨后開始下降。鹽脅迫后GhTFL1b表達量從3 h開始持續(xù)上升，到24 h到達最高，表達量約是對照組的6.4倍(圖4-D)。以上結(jié)果表明，SA能抑制棉花GhTFL1b的表達，鹽脅迫能促進GhTFL1b的表達，而ABA和GA對GhTFL1b的轉(zhuǎn)錄無明顯作用，GhTFL1b可以響應SA和鹽脅迫。

圖4 棉花水培苗經(jīng)過處理后24 h內(nèi)GhTFL1b基因表達量Fig.4 GhTFL1b expression profiles in the first 24 hours after the cotton seeding were treated using hydroponics

2.4 GhTFL1亞組與GhFD蛋白的互作

GhFD是一個b-ZIP轉(zhuǎn)錄因子[18]，該基因在莖端分生組織中優(yōu)勢表達(圖5-A)?？寺∶藁℅hFD基因，連接到pGBKT7載體，檢測是否有自我激活活性和毒性。結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)無毒性，但是存在自我激活活性。將GhFD連接到pGADT7載體，將GhTFL1a/GhTFL1b/GhTFL1c/GhTFL1d蛋白分別連接到pGBKT7載體。雙菌株Y187和Y2H混合培養(yǎng)結(jié)果顯示，GhFD蛋白與GhTFL1b存在互作(圖5-B)。

3 結(jié)論與討論

開花是棉花的重要農(nóng)藝性狀之一。花期的早晚影響產(chǎn)量的高低，也影響品種的區(qū)域適應性。隨著棉花基因組的測序完成[16-17]，對棉花功能基因進行的相關研究越來越多[19-21]，而針對棉花開花基因啟動子的分析和蛋白質(zhì)表達調(diào)控等的研究相對較少。從棉花基因組數(shù)據(jù)庫中共檢索到4條TFL1亞組基因，本研究克隆了GhTFL1b，組織表達和蛋白質(zhì)調(diào)控分析表明，GhTFL1b可以響應水楊酸和鹽脅迫，該基因編碼的蛋白質(zhì)可與轉(zhuǎn)錄因子GhFD蛋白進行互作。

水楊酸是與植物脅迫相關的重要激素，也是遮蔭條件下改善植物光合作用并延長花期的重要因子[22]，其不僅能依賴CO基因調(diào)控的光周期途徑調(diào)節(jié)植物花期，也可以通過抑制開花負調(diào)控因子FLC在自主途徑中促進開花[23-24]。鹽脅迫是常見的一種逆境條件，會對植物根系細胞結(jié)構產(chǎn)生較大影響，如質(zhì)膜透性增大，脂質(zhì)過氧化作用增強，脯氨酸含量增加等[25-26]。擬南芥TFL1家族中BFT基因在高鹽脅迫下通過介導FT-FD模型提供合適的保護機制，適應光周期途徑并促使開花[27-28]。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫處理后GhTFL1b基因高調(diào)表達，水楊酸誘導可使其表達受到抑制，光周期變化不影響該基因表達模式。

AD.轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域；BD.DNA結(jié)合結(jié)構域。AD.Activation domain; BD.DNA binding domain.

FD屬于b-ZIP轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥FD蛋白能結(jié)合FT和TFL1調(diào)控開花時間和花的發(fā)育[29-30]。棉花基因組有10個GhFD基因，其中5條來自A組，5條來自D組[31]。Prewitt等[15]研究證實其中1個棉花FD蛋白與GhSP、GhTFL1、GhBFT蛋白互作。本研究結(jié)果也表明，棉花中1個GhFD能與GhTFL1b互作。棉花其余幾個FD蛋白與磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族間的關系還有待進一步研究。

棉花GhTFL1b與擬南芥TFL1親緣關系相近。擬南芥TFL1基因能延遲開花時間[30]，黃瓜方面的研究表明CsTFL1b能推遲開花并影響花序形態(tài)發(fā)育[32]。馬鈴薯StCEN能調(diào)節(jié)莖尖分生組織的發(fā)育，進一步調(diào)控株型發(fā)育[33]。因此，還需通過轉(zhuǎn)基因棉花驗證，并對轉(zhuǎn)基因后代株系進行脅迫處理，進一步研究掌握GhTFL1b基因的功能。