史 麗，吳亞茹，王曉娟，常燕楠，龐鵬湘，郜 剛

(山西師范大學 生命科學學院，山西 臨汾 041000)

植物的生長發(fā)育常常受到干旱、鹽度等非生物脅迫的影響[1]。轉錄因子調控下游基因的表達，是植物適應非生物脅迫的關鍵因子[2]。NF-Y轉錄因子可通過差異表達、選擇性剪接、細胞氧化還原電位等相互作用，來調節(jié)其活性[3]。NF-YC含有組蛋白折疊基序(HFMs)，并且通過 HFMs相互作用首尾相接組裝形成異二聚體，再與NF-YA相互作用形成NF-Y轉錄因子。在DNA和NF-Y轉錄的結合中都發(fā)揮重要的作用[4]。NF-YC蛋白的保守域中含有1個與H2A蛋白結構類似的HFM結構域，在蛋白-蛋白和蛋白-DNA的互作中發(fā)揮重要作用。

NF-Y被稱為血紅素激活蛋白(HAP)或CCAAT結合因子(CBF)，是所有真核生物中存在的三聚體轉錄因子[5]。在植物中，其生物學功能主要表現(xiàn)在開花進程、胚胎發(fā)育、葉綠體發(fā)育、應激反應等多方面的調控[6]。已證實，番茄NF-Y因子在調節(jié)果實成熟中起重要作用，不同的NF-Y因子在番茄果實成熟過程中的作用可能不同[7]。另外，有研究表明，NF-Y基因過表達會增強小麥的耐旱性[8]。1995年，Albani等[9]從擬南芥中分離出了第1個NF-YC家族成員AtNF-YC2。AtNF-YC2亞基的過表達加速了植物的開花過程并提高了植物的轉錄水平[10]。1998年Edwards等[11]首次鑒定出擬南芥中有13個NF-YC亞基。此外，E Z等[12]研究表明，NF-Y可能在單子葉植物中分化以調節(jié)胚乳發(fā)育。NF-YC亞基的過表達會增強水稻植株的抗鹽性。Chen等[13]研究表明，NO、H2O2和ABA參與鹽脅迫誘導的NF-YC基因的表達，當沒有H2O2、NO分子或者ABA合成受阻時，NF-YC基因的表達終止。2006年，Ben-Naim等[14]研究表明，CCT存在于多數(shù)開花相關蛋白中，擬南芥中的NF-YC與CCT保守域互作，從而調控植株開花時間，番茄中的NF-YC也參與開花時間調節(jié)子的調節(jié)。AtNF-YC與AtNF-YB結合成二聚體，參與到光周期開花途徑中[15]。云杉中的NF-YC亞基過表達時促進花粉管的發(fā)育[16-17]。此外，NF-YC參與小麥中有關光合作用相關基因表達的調控；在水稻中，NF-Y轉錄因子喪失功能后，葉綠體退化，降低了葉綠素含量[18]。

本研究從山西師范大學生命科學學院基因工程實驗室前期的試驗中獲得1條馬鈴薯EST序列[19]，使用電子克隆方法獲得馬鈴薯NF-YC基因的全長cDNA，對其進行生物信息學分析。關于馬鈴薯青枯菌植病互作產(chǎn)生的NF-YC基因的研究鮮見報道。因此，分離和鑒定馬鈴薯與青枯菌互作誘導產(chǎn)生的NF-YC基因，通過相關生物信息學軟件對其生物學功能和作用機制的預測和研究，旨在為后期的基因功能研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試植物材料選用的是青枯菌高抗基因型ED13，由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供，青枯菌選用的是菌株PO41、生理小種3號(race3)、生化變種2號(biovar2)。取九葉期至十葉期試管苗，參照He等[20]傷根灌菌接種法接種青枯菌。

1.2 試驗方法及電子克隆

山西師范大學生命科學學院基因工程實驗室前期試驗中得到1條馬鈴薯EST序列，長度為796 bp，通過NCBI BlastN同源比對檢索，以馬鈴薯NFYC-1-Like(XM_015310514.1)為參考序列，運用電子克隆方法進行比對、拼接，直到序列能完整翻譯，進而獲得NF-YC全長序列。將其與馬鈴薯全基因組序列數(shù)據(jù)庫中可用的序列進行比對[21]。

1.3 馬鈴薯NF-YC基因的生物信息學分析

馬鈴薯NF-YC基因的核酸及氨基酸組成、編碼蛋白的理化性質、開放閱讀框(Open reading frame)的翻譯與尋找分別采用Bioedit、Prot-Param和ProtScale服務器及ORF dinder等在線工具完成。親、疏水性、蛋白質的磷酸化位點和亞細胞定位、信號肽和跨膜區(qū)分析利用在線工具ProtScale、NetPhos 3.1、TargetP 1.1、SignalP 4.1、TMHMM 2.0軟件完成。保守結構域通過在線工具NCBI中的CDD(Conserved Domain Database)預測。蛋白質二級和三級結構預測通過SOPMA和CPH Models 3.2 Server等在線工具完成，三級結構用 Accelrys DS Visualise軟件顯示結果。N-J(Neighbor-Joining)法系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA軟件[22]完成(表1)。

表1 生物信息學分析所用的在線分析工具Tab.1 The online tools used in bioinformatics analysis

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯NF-YC基因cDNA全長的獲取

在本實驗室前期得到1條馬鈴薯EST序列，以馬鈴薯NFYC-1-Like(XM_015310514.1)為參考序列，在NCBI BlastN中通過同源比對，同源性達到99%。通過電子克隆方法，經(jīng)過比對、拼接，獲得NF-YC全長cDNA序列，長度為1 132 bp。通過與馬鈴薯全基因組數(shù)據(jù)庫比對，將其命名為StNF-Y。GenBank登錄號(Accession No.) ：MH 919392.1。

2.2 馬鈴薯StNF-Y理化性質預測

利用ExPasy在線工具中的ProtParam預測馬鈴薯StNF-Y蛋白的理化性質[23]，結果如表2所示，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為63.54，大于40，說明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；平均疏水性為-0.503，初步判斷該基因為親水性蛋白。由圖1 可知，該蛋白在第100-140個氨基酸之間出現(xiàn)最大疏水值2.2，在第100-120個氨基酸之間出現(xiàn)最小親水值-2.833，且峰值分布在0 以下比分布在0以上的多，再次證明該蛋白為親水性蛋白。在馬鈴薯StNF-Y氨基酸組成中，含量最高的為Asn(97個，占42.17%)，含量最低的為Cys(1個，占0.43%)。

表2 StNF-Y蛋白一級結構預測Tab. 2 Predicting primary structure of StNF-Y protein

圖1 StNF-Y蛋白親水性/疏水性預測Fig.1 Prediction of hydrophilicity/hydrophobicity of StNF-Y protein

2.3 馬鈴薯StNF-Y基因全長cDNA及氨基酸序列分析

利用BioEdit軟件分析，馬鈴薯StNF-Y的全長cDNA長度為1 132 bp，終止密碼子為TAA，編碼230個氨基酸(圖2)。

2.4 保守域預測及氨基酸同源序列比對分析

使用NCBI保守結構域數(shù)據(jù)庫(Conserved Domain Database，CDD)[24]，分析馬鈴薯StNF-Y蛋白的保守結構域結果顯示(圖3)，該蛋白含有多個保守結構域，主要屬于BUR6 superfamily家族，該結構域位于第44-141個氨基酸。提交NF-YC基因的氨基酸序列，BlastP搜索StNF-Y的同源氨基酸序列。DNAMAN軟件用于馬鈴薯StNF-Y蛋白和其他物種NF-YC蛋白的氨基酸序列的多重比對[25]，利用Blast P對StNF-Y基因編碼的氨基酸同源性進行檢

上排為cDNA 序列，下排為氨基酸序列；ATG 為起始密碼子，*代表終止密碼子；下劃線標注的為BUR6 superfamily結構域。

The upper lines are cDNA sequences，the lower lines are amino acid sequences; ATG is the start codon，* is the stop codon; Underlined is the BUR6 superfamily domain.

圖2StNF-YcDNA序列以及推導的氨基酸序列
Fig.2StNF-Ygene cDNA sequence anddeduced amino acid sequence

索，馬鈴薯StNF-Y基因編碼的氨基酸與番茄Solanumpennellii(XP_015070179.1)、辣椒Capsicumchinense(PHU23636.1)、馬鈴薯Solanumlycopersicum(NP_001234244.1)、煙草Nicotianaattenuata(XP_019248263.1)中的NF-YC蛋白的氨基酸序列具有較高的相似性，分別為94%，93%，84%，81%。結果顯示(圖4)，StNF-Y結構域的氨基酸序列高度保守。

圖3 StNF-Y蛋白的保守結構域分析Fig.3 Conserved domain prediction of StNF-Y protein

圖4 馬鈴薯StNF-Y蛋白與其他植物 NF-YC蛋白的同源性比對Fig.4 Homology comparison of potato StNF-Y protein with other plant NF-YC proteins

2.5 蛋白分子磷酸化位點分析

使用NetPhos 3.1 Server對該氨基酸進行磷酸化位點分析，結果顯示，其共有13個磷酸化位點，Ser磷酸化位點6個，分別位于第82，157，190，200，205，214個氨基酸上；Thr磷酸化位點4個，分別在第26，101，115，158個氨基酸上；3個Tyr磷酸化位點位于第24，192，215個氨基酸上。據(jù)推測，StNF-Y蛋白的活性與功能可能通過這些位點的磷酸化反應來調節(jié)。

2.6 蛋白的信號肽、跨膜區(qū)、亞細胞定位分析

通過使用SignalP 4.1 Server預測蛋白質序列的信號肽，結果顯示無信號肽段出現(xiàn)。使用TMHMM Server 2.0[26]預測蛋白質的跨膜區(qū)，結果顯示該蛋白是一種膜外蛋白，沒有跨膜區(qū)。使用TargetP 1.1 Server服務器[27]分析蛋白質亞細胞定位，結果顯示StNF-Y轉錄因子主要位于胞質中的概率最大。

2.7 馬鈴薯StNF-Y轉錄因子二級結構分析

在Expasy的SOPMA服務器[28]中在線預測馬鈴薯StNF-Y轉錄因子的二級結構，結果如圖5所示，105個氨基酸可形成α-螺旋，占氨基酸總數(shù)的45.65%；13個氨基酸可形成延伸鏈，占氨基酸總數(shù)的5.65%；104個氨基酸可形成無規(guī)則卷曲，占氨基酸總數(shù)的45.22%。8個氨基酸形成β-轉角，占氨基酸總數(shù)的3.48%。

圖5 StNF-Y蛋白的二級結構預測Fig.5 Secondary structure prediction of StNF-Y protein

2.8 馬鈴薯StNF-Y轉錄因子三級結構分析

利用CPHmodels 3.2 Server預測StNF-Y的三級結構發(fā)現(xiàn)，目前PDB數(shù)據(jù)庫中尚未有全長氨基酸序列匹配的模板，只能構建其保守序列的3D模型(圖6)，完整的StNF-Y三級結構由α-螺旋、β-轉角和無規(guī)則卷曲形成，在C端是α-螺旋，在N端有一個較短的伸展肽段(EP)。

圖6 StNF-Y保守序列(48-140)的三級結構Fig.6 3D structure of the conserved domain (48-140)of the predicted amino acids

2.9 系統(tǒng)進化樹構建

通過NCBI上的BlastP獲得氨基酸序列的同源序列，使用MEGA 4.0軟件，采用N-J法構建系統(tǒng)進化樹(時間截止到2018年11月15日)，結果如圖7所示，系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，馬鈴薯StNF-Y轉錄因子編碼的氨基酸序列與番茄親緣關系最近，與辣椒親緣關系次之，與棉花親緣關系最遠。

圖7 基于StNF-Y蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of StNF-Y protein

3 結論與討論

本研究在山西師范大學生命科學學院基因工程實驗室前期工作中利用電子克隆技術拼接，獲得了馬鈴薯StNF-Y基因的全長序列，并通過生物信息學方法對該基因的結構特征、功能屬性和表達性質等方面進行了系統(tǒng)分析，其核苷酸和氨基酸序列都高度保守，核苷酸序列在茄科植物中保守性高達95%～100%，表明StNF-Y在進化上很保守，這可能與其重要功能有關。馬鈴薯StNF-Y轉錄因子全長1 132 bp，編碼230個氨基酸，磷酸化位點有13個，StNF-Y是親水性氨基酸，無信號肽。通過更進一步的預測發(fā)現(xiàn)，StNF-Y蛋白含有BUR6保守功能結構域，屬于BUR6 superfamily家族，并且對蛋白質的結構和功能都至關重要。該蛋白質的二級結構有4種結構形式：α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規(guī)則卷曲，這為實現(xiàn)其功能提供了結構基礎。通過氨基酸多序列比對及構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)該蛋白與馬鈴薯、番茄、辣椒、煙草、牽?；ㄖ械暮宿D錄因子親緣關系較近，說明StNF-Y蛋白在生物進化過程中高度保守。

近年來，已經(jīng)分離和鑒定了越來越多的植物NF-Y基因，其中包括擬南芥[29]、大豆[30]、甘藍型油菜[31]、葡萄[32]、柑橘[33]等。目前，關于擬南芥中的NF-Y基因研究的較多，其次是番茄、小麥、水稻等。NF-Y由NF-YA、NF-YB和NF-YC亞類TF組成，已被證明參與植物許多生長發(fā)育過程的調節(jié)和對各種環(huán)境脅迫刺激的反應[34]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，NF-YC轉錄因子在糖異生過程和植物胚乳發(fā)育中起重要作用。Zhang等[35]研究結果表明，NF-Y基因通過上調糖異生基因Pck1和G6pc來控制葡萄糖代謝的生理功能。此外，NF-Y基因也參與植物對非生物脅迫的反應[36]。擬南芥NF-YC3/4/9與ABI 5啟動子的CCAAT元件結合，激活其在種子萌發(fā)過程中的表達及整合GA和ABA信號轉導途徑[37]。已證實，NF-Ys參與了植物響應干旱反應的ABA信號傳遞[38]。前幾年，有研究表明，NF-Y轉錄因子能引起植物對干旱脅迫的反應，主要是通過影響葉綠素含量、光合作用、開花進程等對植物生理過程進行調控。這與本試驗所用的原始序列來源相一致，初步推測，其可能同以往發(fā)現(xiàn)的其他植物的NF-YC轉錄因子一樣參與相關防御反應。

進一步確定馬鈴薯StNF-Y蛋白在植株中實際的功能表達，還需要具體的分子生物學試驗來驗證。有必要針對該基因表達的精細細胞定位和信號調控進行進一步的深入研究，這對于解釋早期馬鈴薯與青枯病的植病互作機制、進行馬鈴薯育種乃至為今后青枯病的控制提供新的目標具有重要的理論意義。