陳 東，李 強(qiáng)，彭 彥，吳天昊，張秀麗，董家瑜，毛畢剛，趙炳然

(1.湖南大學(xué) 研究生院隆平分院，雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410125; 2.湖南雜交水稻研究中心，湖南 長沙 410125)

水稻是全球重要的糧食作物之一。隨著勞動(dòng)成本的逐年升高，輕簡栽培將是未來我國水稻的主要種植方式[1]。水稻直播技術(shù)因其無需育秧移栽、無返青期、省時(shí)省力、操作簡單、效率高等特點(diǎn)而越來越受歡迎[2]。然而，全苗、壯苗技術(shù)一直是影響直播稻總產(chǎn)量的因素之一[3]。直播種子萌發(fā)時(shí)稻田積水將顯著影響出苗率和成活率，稻田積水主要對(duì)幼苗形成低氧脅迫，抑制水稻生長[4-5]。研究表明，僅4 d的淹水脅迫，水稻產(chǎn)量就受到不同程度的降低[6]。

早期淹水對(duì)水稻幼苗生長發(fā)育的影響主要原因并不在于水分本身，而是由于過量的水分誘導(dǎo)的次生脅迫[7-10]，如缺氧等。在稻田沒頂淹水的情況下，水稻生理生化和形態(tài)特征都會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，主要表現(xiàn)為：乙烯(ETH)大量生成，內(nèi)源赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)活性升高；有氧代謝途徑受阻，無氧代謝途徑增強(qiáng)；質(zhì)膜透性增加，MDA含量升高，離子滲漏量增加；酶系統(tǒng)異常，蛋白質(zhì)合成受阻，分解速度加快，原生質(zhì)結(jié)構(gòu)遭破壞；胚芽鞘和中胚軸伸長，莖節(jié)部位長出部分不定根和不定芽，根毛減少，根系不再生長等[11-15]。因此，研究相關(guān)的耐受措施，增強(qiáng)水稻在淹水脅迫下的存活率和出苗能力，對(duì)減免水稻直播栽培因播種后漬澇帶來的減產(chǎn)具有重要意義。

褪黑素(Melatonin，美拉酮寧，簡稱MT)作為一種新興的植物生理調(diào)節(jié)激素，MT最初是在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，由大腦中松果體腺所合成，因此又稱松果體素。化學(xué)名稱為N-乙?；?5-甲氧基色胺，分子式為C13N2H16O2，因其結(jié)構(gòu)中的5-OCH3和N-Ac官能團(tuán)的存在，決定了MT自身具有親水性和高親脂性，也決定了其與受體結(jié)合的特異性[16-17]。MT的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物功能與生長素(IAA)相類似，因此也對(duì)光照敏感，可以有效清除自由基，在組織體內(nèi)無限制轉(zhuǎn)移[18-22]。

MT廣泛存在于各類高等植物體中，盡管在植物體內(nèi)MT含量非常低[23]，但在增強(qiáng)植物抗逆性上發(fā)揮著重大的作用，特別是在抗氧化脅迫(例如干旱脅迫增強(qiáng)小麥抗氧化能力[24])。相較于其他抗氧化劑(如維生素E、谷胱甘肽)，MT的抗氧化能力更強(qiáng)，同時(shí)MT的加入還可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)其他抗氧化劑(如抗壞血酸和谷胱甘肽)的合成[25]，它可以緩解高鹽脅迫、紫外、電離輻射、重金屬、干旱、高溫、低溫等多種逆境壓力對(duì)高等植物的損害[26-31]，但在增強(qiáng)水稻幼苗抗淹水脅迫上鮮有報(bào)道。

水稻淹水過后易受到活性氧(ROS)誘導(dǎo)的膜脂過氧化作用的傷害，氧自由基氧化脂質(zhì)不飽和脂肪酸，生成過氧化脂質(zhì)；后者逐漸分解成一系列復(fù)雜的化合物，其中包括丙二醛(MDA)[32-33]。本研究通過測(cè)定淹水脅迫后幼苗相關(guān)農(nóng)藝性狀、保護(hù)酶系統(tǒng)的酶活以及MDA含量等生理生化指標(biāo)，分析不同濃度褪黑素浸種對(duì)長、短中胚軸水稻耐淹效果的影響[34]，為水稻直播技術(shù)的改良與發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用湖南雜交水稻研究中心趙炳然課題組淹水處理篩選的長中胚軸品種鄂中4號(hào)和DH4038，短中胚軸品種華航31和DH4040。其中鄂中4號(hào)和華航31為常規(guī)稻品種，DH4038和DH4040來自中科院遺傳與發(fā)育學(xué)研究所儲(chǔ)成才課題收集的代表全球水稻多樣性微核心種質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)方法

種子先用1%的次氯酸鈉消毒20 min，然后用滅菌蒸餾水沖洗5遍。種子消毒后，統(tǒng)一浸種、催芽。浸種時(shí)用MT處理，MT設(shè)置3種濃度，分別為10，100，1 000 μmol/L，以滅菌蒸餾水浸種作為對(duì)照[35-36]。浸種48 h后，37 ℃催芽18 h。共組成16種試驗(yàn)處理，每個(gè)品種3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取萌發(fā)一致的種子200粒，其中100粒用作生理指標(biāo)和農(nóng)藝性狀測(cè)定，另外100粒用作成活率的測(cè)定，放置在萌發(fā)板上，相同處理的材料放置在同一黑色水培箱中，設(shè)置淹水高度10 cm。溫室28 ℃黑暗條件下處理7 d，每天固定時(shí)間在黑暗或弱光的環(huán)境中換水。7 d后，用刻度尺測(cè)量每個(gè)水稻品種幼苗的中胚軸長、胚芽鞘長和芽長，用分析天平稱量幼苗鮮質(zhì)量。MDA含量及POD、SOD、CAT活性測(cè)定試劑盒均由蘇州科銘試劑公司提供。吸光度使用酶標(biāo)儀EnSpire 2300 Multilabel Reader測(cè)定。成活率測(cè)定材料在淹水處理后放置于漂浮板上，28 ℃，光培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h，15 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本的計(jì)算和作圖，SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)及ANOVA分析，組間采用Duncan′s多重比較(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MT浸種對(duì)水稻幼苗農(nóng)藝性狀的影響

在淹水處理下，DH4038的中胚軸長度最長，均值為0.52 cm，華航31的中胚軸長度最短，均值為0.14 cm(圖1)。3種濃度的MT浸種均能提高4個(gè)水稻品種的中胚軸伸長能力，使用100，1 000 μmol/L的MT浸種效果均達(dá)到顯著水平，100 μmol/L MT浸種效果最好。MT對(duì)短中胚軸品種提升中胚軸伸長能力更為明顯，使用10，100，1 000 μmol/L MT浸種，華航31的提升幅度均最為明顯，中胚軸長度分別增加33.06%，80.65%，70.97%。

不同小寫字母表示同一品種不同濃度褪黑素浸種處理間差異顯著(P<0.05)，多重比較采用Duncan′s多重比較法。圖2-9同。Different small letters within the same rice varieties mean significant difference among different melatonin soaking-seeds treatments. Duncan′s multiple range test，at 5% level.The same as Fig.2-9.

長中胚軸品種鄂中4號(hào)和DH4038相比短中胚軸品種華航31和DH4040具有較強(qiáng)的胚芽鞘伸長能力(圖2)。施加MT均能增強(qiáng)4種水稻品種胚芽鞘伸長能力，低濃度的MT浸種對(duì)長中胚軸品種鄂中4號(hào)和DH4038效果較好，而高濃度的MT浸種對(duì)短中胚軸品種華航31和DH4040效果更為明顯。

10 μmol/L MT浸種具有提升水稻胚芽鞘伸長能力的趨勢(shì)。使用100 μmol/L的MT浸種對(duì)提升長中胚軸品種鄂中4號(hào)和DH4038胚芽鞘伸長能力具有顯著效果。10，100 μmol/L的MT浸種對(duì)鄂中4號(hào)的處理效果最好，胚芽鞘長度分別提升3.44%，7.42%。當(dāng)使用濃度1 000 μmol/L的MT浸種時(shí)均能顯著促進(jìn)胚芽鞘伸長，且對(duì)短中胚軸品種華航31和DH4040效果更為明顯，分別提升10.62%和12.76%。

圖2 MT浸種對(duì)淹水脅迫下幼苗胚芽鞘伸長的影響Fig.2 Effect of MT-soaking treatment on seedling coleoptile length under submergence stress

長中胚軸品種同時(shí)也伴有更長的幼芽(圖3)。淹水處理后，DH4038具有最強(qiáng)的幼芽伸長能力，均值為5.77 cm，其次為鄂中4號(hào)，均值為4.57 cm。

MT浸種對(duì)芽長影響不明顯，但高濃度下(1 000 μmol/L)所有的水稻品種芽長有一定的抑制趨勢(shì)。其中對(duì)短中胚軸品種DH4040和華航31抑制效果最為明顯，分別達(dá)到10.17%和5.31%。

圖3 MT浸種對(duì)淹水脅迫下幼苗芽長的影響Fig.3 Effect of MT-soaking treatment on seedling shoot length under submergence stress

淹水處理下相比短中胚軸品種華航31和DH4040，長中胚軸品種鄂中4號(hào)和DH4038具有更高的鮮質(zhì)量(圖4)。10，100 μmol/L MT浸種對(duì)4種水稻品種的鮮質(zhì)量均有顯著的提升效果，而1 000 μmol/L MT浸種對(duì)DH4038和DH4040具有顯著抑制效果。

10，100 μmol/L MT浸種能顯著提高4種水稻品種的鮮質(zhì)量。其中10 μmol/L MT浸種下，DH4040提升效果最為明顯，達(dá)到7.69%。使用100 μmol/L MT浸種，DH4038促進(jìn)效果最好，達(dá)到14.62%。當(dāng)MT濃度提高到1 000 μmol/L后，對(duì)鄂中4號(hào)和華航31的處理效果不明顯，而對(duì)于DH4038和DH4040具有顯著的抑制效果，對(duì)DH4040抑制率達(dá)到3.85%。

圖4 MT浸種對(duì)淹水脅迫下幼苗鮮質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of MT-soaking treatment on seedling fresh weight under submergence stress

2.2 MT對(duì)水稻幼苗成活率的影響

淹水處理下相比短中胚軸品種華航31、DH4040，長中胚軸品種鄂中4號(hào)、DH4038具有較高的成活率(圖5)。一定濃度的MT浸種均能提高淹水脅迫下幼苗的成活率，但隨著MT濃度的提高，MT表現(xiàn)為降低水稻幼苗的成活率。在對(duì)4個(gè)品種添加10，100 μmol/L的MT浸種時(shí)，華航31中MT浸種效果表現(xiàn)均是最好的，其幼苗成活率分別提高19.36，22.53百分點(diǎn)。其中100 μmol/L MT浸種處理在每個(gè)品種中均能顯著提高幼苗的成活率。隨著濃度提高到1 000 μmol/L，對(duì)鄂中4號(hào)和華航31具有抑制成活的趨勢(shì)。對(duì)DH4038和DH4040具有顯著的抑制效果，成活率分別降低為22.35，17.83百分點(diǎn)。

圖5 MT浸種對(duì)淹水脅迫下幼苗成活率的影響Fig.5 Effect of MT-soaking treatment on seedling survival rate under submergence stress

2.3 MT對(duì)水稻幼苗 MDA含量和POD、CAT、SOD活性的影響

相比于長中胚軸品種，短中胚軸品種在淹水處理下具有較高的MDA含量(以鮮質(zhì)量計(jì))(圖6)。MDA含量最高的為華航31(18.92 nmol/g)，最低的為鄂中4號(hào)(12.04 nmol/g)。10 μmol/L MT浸種在4個(gè)水稻品種中有降低MDA的趨勢(shì)，其中可以顯著降低短中胚軸品種華航31和DH4040中MDA含量。降幅分別為21.82%和28.71%。100 μmol/L MT浸種下，效果達(dá)到最大化，華航31和DH4040降幅分別為53.64%和41.58%。然而，當(dāng)MT的濃度提升到1 000 μmol/L時(shí)，MDA含量降低到與10 μmol/L MT處理基本相同的水平(與對(duì)照組相比均無顯著性差異)，浸種處理效果有所下降。

圖6 MT浸種對(duì)淹水脅迫下幼苗MDA含量的影響Fig.6 Effect of MT-soaking treatment on seedling MDA content under submergence stress

淹水處理下相比短中胚軸品種華航31和DH4040，長中胚軸品種鄂中4號(hào)和DH4038具有較高的POD活性(以鮮質(zhì)量計(jì))(圖7)。DH4038的POD活性最高，達(dá)到16.61×103U/g。添加10，100，1 000 μmol/L MT浸種，均能顯著提高水稻POD活性。100 μmol/L MT為提高POD活性效率最適宜濃度，相比蒸餾水處理組，鄂中4號(hào)、華航31、DH4040和DH4038提升幅度分別為57.11%，86.86%，73.60%和99.05%。

圖7 MT浸種對(duì)淹水脅迫下幼苗POD活性的影響Fig.7 Effect of MT-soaking treatment on seedling POD activity under submergence stress

淹水處理下相比短中胚軸品種華航31和DH4040，長中胚軸品種鄂中4號(hào)和DH4038具有較高的CAT活性(以鮮質(zhì)量計(jì))(圖8)，在鄂中4號(hào)中最高，達(dá)到64.26 nmol/(min·g)。添加MT浸種，有提升CAT活性的趨勢(shì)，并且隨著濃度的提高，提升效果越好。在DH4038中MT對(duì)提升CAT活性效果最明顯，在10，100，1 000 μmol/L MT的處理下，DH4038的CAT活性分別提高為26.67%，46.67%和53.33%。DH4038也是唯一提升幅度達(dá)到顯著差異的品種。

圖8 MT浸種對(duì)淹水脅迫下幼苗CAT活性的影響Fig.8 Effect of MT-soaking treatment on seedling CAT activity under submergence stress

淹水處理下相比短中胚軸品種華航31和DH4040，長中胚軸品種鄂中4號(hào)和DH4038均具有較高的SOD活性(以鮮質(zhì)量計(jì))(圖9)，DH4038最高，達(dá)到398.79 U/g。添加MT浸種，能提高SOD活性，并且隨著MT濃度的提高，提升效果越好。當(dāng)濃度到達(dá)1 000 μmol/L MT，與不添加MT處理相比，4種水稻品種均達(dá)到了顯著水平。其中，在短中胚軸品種華航31和DH4040中有較好的提升效果。且在華航31中SOD的活性提升最明顯，在10，100，1 000 μmol/L MT的處理下，華航31的提升幅度分別為39.02%，73.04%，73.96%。

圖9 MT浸種對(duì)淹水脅迫下幼苗SOD活性的影響Fig.9 Effect of MT-soaking treatment on seedling SOD activity under submergence stress

3 結(jié)論與討論

本研究所選用的水稻品種是關(guān)于淹水脅迫下中胚軸伸長的種質(zhì)材料，發(fā)現(xiàn)在淹水脅迫下不同的中胚軸伸長材料具有不同的成活率，添加適宜濃度的MT能顯著緩解淹水脅迫作用，提高所有品種的成活率，并且在短中胚軸品種中效果更為明顯。

淹水處理7 d后，相比短中胚軸品種華航31、DH4040，長中胚軸品種鄂中4號(hào)、DH4038有較高的成活率，說明鄂中4號(hào)和DH4038均采用的是避淹策略[37]，適合與水面緩慢升高或淹水較淺的脅迫環(huán)境下，通過迅速伸長生長，使葉片能伸出水面與空氣相接觸。隨著農(nóng)業(yè)技術(shù)和農(nóng)田灌溉的提高，淹澇后的農(nóng)田能有效地在短時(shí)間內(nèi)排水。鄂中4號(hào)和DH4038更適宜短時(shí)間內(nèi)淹澇脅迫下的直播種植方式。

使用一定MT浸種處理，4種水稻品種的成活率大幅度提升，說明適宜濃度的MT能顯著提高水稻耐淹澇能力，值得注意的是，適宜濃度的MT對(duì)提升短中胚軸品種華航31和DH4040的成活率更為明顯。因此，在實(shí)際的大田生產(chǎn)中可以制成相關(guān)的浸種劑或者種子包衣，促進(jìn)幼苗出水，提高水稻耐淹澇能力。另外，MT成本低廉，容易獲得，規(guī)?；褂脮r(shí)成本不高，具有潛在的應(yīng)用前景。然而，當(dāng)MT濃度過高時(shí)，幼苗成活率降低，說明過量的MT對(duì)水稻不僅沒有緩解淹澇脅迫，還對(duì)水稻幼苗具有毒害作用，因此在實(shí)際的生產(chǎn)中需要選擇合適的MT濃度進(jìn)行浸種。

長中胚軸品種鄂中4號(hào)和DH4038鮮質(zhì)量更大，生長更快。使用一定濃度的MT浸種處理能顯著提高中胚軸長、胚芽鞘長和鮮質(zhì)量，較高濃度下對(duì)胚芽鞘長具有抑制效果，不同濃度的MT對(duì)芽長影響不大，但是隨著濃度的升高，有降低芽長的趨勢(shì)。短中胚軸品種華航31和DH4040在MT浸種處理下能有效提高中胚軸長、胚芽鞘長和鮮質(zhì)量。說明其生活力得到有效提高，同時(shí)成活率也相應(yīng)提高。

淹水脅迫下相比華航31和DH4040，鄂中4號(hào)和DH4038具有較低的MDA含量水平，說明體內(nèi)脂質(zhì)氧化程度更低。使用100 μmol/L MT浸種處理時(shí)，4種水稻品種中均具有顯著降低MDA含量的效果，其中華航31和DH4040效果更為明顯，說明合適濃度的MT能顯著降低淹水脅迫下水稻體內(nèi)過氧化水平以及次生代謝產(chǎn)物所造成的毒害作用。

相比華航31和DH4040，鄂中4號(hào)和DH4038具有更高的POD、SOD和CAT活性。SOD是超氧化物陰離子清除酶，也是H2O2主要生成酶，CAT最主要的H2O2清除酶，POD具有消除H2O2、胺和酚毒性的多重作用。由此可以看出，SOD活性的提高，會(huì)加快生成H2O2，同時(shí)POD和CAT的相應(yīng)提高可以清除產(chǎn)生的H2O2。

MT浸種處理能顯著提高POD和SOD的活性，對(duì)CAT活性有提高的趨勢(shì)。其中100 μmol/L MT對(duì)POD活性的促進(jìn)效果最好，即降低水稻體內(nèi)過氧化水平；1 000 μmol/L MT對(duì)CAT和SOD活性促進(jìn)效果更好。由于1 000 μmol/L MT下SOD活性相比POD和CAT提升的更快，產(chǎn)生了更多的H2O2，在此濃度下MDA含量也有所提高，即更為嚴(yán)重的氧化損傷，所以更高濃度的MT表現(xiàn)為抑制水稻的生長，降低水稻淹水過后的成活率。Kanazawa等[38]報(bào)道，SOD/CAT、SOD/POD 比值的提高會(huì)進(jìn)一步增加植物體的氧化脅迫。這與劉仕翔等[36]研究的鎘脅迫和張娜[39]研究的鹽脅迫所得的結(jié)果相同，即適宜低濃度的MT對(duì)逆境脅迫下的水稻生長具有顯著的緩解作用，其作用主要是通過緩解氧化性損傷和促進(jìn)植物幼苗生長，而過高濃度下的MT對(duì)逆境脅迫無明顯的緩解作用或呈負(fù)面作用，這可能是因?yàn)楦邼舛鹊腗T對(duì)植物的生長具有毒害作用。

用中低濃度的MT浸種對(duì)淹水脅迫下的水稻生長有緩解脅迫的作用，而高濃度的MT浸種卻加劇對(duì)水稻幼苗的毒害。10，100 μmol/L MT浸種降低MDA含量，提高POD、SOD、CAT的活性，提高中胚軸長、胚芽鞘長、鮮質(zhì)量等農(nóng)藝性狀，提高幼苗成活率。1 000 μmol/L MT浸種亦可以提高相關(guān)農(nóng)藝性狀和酶活性，但是，POD和SOD未能同步提高，引起水稻體內(nèi)的生理失衡，使得成活率顯著下降。所以，適當(dāng)濃度的MT浸種，能提高淹水脅迫下水稻幼苗活力和出苗率。MT有望作為直播水稻種子浸種劑或者種子包衣成分。