王超楠，張 斌，張 紅，溫娟娟，王 濤

(1.天津科潤蔬菜研究所,蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室,天津市蔬菜遺傳育種企業(yè)重點實驗室，天津 300384；2.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387)

大白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)是十字花科蕓薹屬中的常見蔬菜，種植和分布面積廣，是我國菜籃子中的重要蔬菜。近年來，由于蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron.)的侵染，大白菜根腫病頻發(fā)，且在世界范圍內(nèi)的危害面積日益擴大，導致大白菜的品質(zhì)和產(chǎn)量受到了極大影響，嚴重時甚至導致絕收，該病現(xiàn)已成為大白菜育種過程中亟須解決的問題[1]。由于根腫菌在土壤中的存活時間長，攜帶休眠孢子的土壤很容易導致病害的持續(xù)發(fā)生[2]，而且利用農(nóng)業(yè)、化學和生物等防治手段不能從根本上解決根腫病的防治問題，所以，培育抗根腫病的大白菜新品種是防治該病的最佳方法。

傳統(tǒng)育種方法周期長，選擇準確性差，極易受到外界環(huán)境的影響，造成病菌的傳播。而利用與目標基因緊密連鎖的分子標記對抗病性進行選擇，不受植株生長發(fā)育時期和環(huán)境條件的限制，降低了誤選目的基因的可能性，顯著提高了目標性狀選擇的準確性和抗病育種工作的效率[3-7]。因此，本研究對抗根腫病基因進行初定位，篩選與抗根腫病基因連鎖的分子標記，為分子標記輔助選擇培育抗根腫病大白菜新品種提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料：感病親本為津白56的高代自交系G4，抗病親本為藥膳春的高代自交系G6，G4和G6雜交獲得的F1，F(xiàn)1自交構(gòu)建的F2分離群體。所有試材均由天津科潤蔬菜研究所大白菜課題組提供。

人工接種所用根腫病菌株采自湖北省恩施市火燒坪鄉(xiāng)的大白菜根腫病發(fā)病腫根。

供試分子標記引物：共計680個，包括文獻中已發(fā)表的與大白菜抗根腫病基因連鎖的引物標記29個[8]，王艷[9]構(gòu)建的大白菜遺傳圖譜中的415個InDel和92個SSR標記引物，大白菜基因組數(shù)據(jù)庫Brassica Database(http：//brassicadb.org)中的144個SSR標記引物。以上引物均由華大基因合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工接種根腫菌與育苗培養(yǎng) 采用菌土法[10]進行人工接種，將帶有根腫菌的腫根放入組織攪拌機內(nèi)，再加入適量蒸餾水打成勻漿制成孢子懸浮液，然后和滅菌土混合，使菌土孢子含量達到108個/g[11-12]，pH值調(diào)至6.5左右，含水量控制在60%[13]。

2016年3月，所有供試材料均播種于天津科潤蔬菜研究所的溫室內(nèi)。抗、感親本及F1各播種25株，F(xiàn)2群體播種500株。播種后苗盤置于溫室通風陰涼處，溫度控制在20～25 ℃，避免陽光長時間直曬，苗盤下保持1 cm水層，正常管理。

1.2.2 根腫病抗性鑒定與病情調(diào)查 2016年4月，在接菌培養(yǎng)30 d后，對親本、F1和F2群體進行人工接種的抗病性鑒定。將每個單株從育苗盤里取出，用清水洗凈根部后觀察記錄發(fā)病情況，并采集以上所有單株新鮮葉片2～3片，編號放入對應的自封袋中，-80 ℃保存，用于基因組DNA的提取。

大白菜苗期根腫病病情調(diào)查方法和分級標準參考王彤彤[14]和Piao等[15]的描述，按照0～7級標準調(diào)查單株發(fā)病情況(圖1)，0，1 級記為抗病，3，5，7級記為感病。根據(jù)以上鑒定結(jié)果，對其分離情況進行χ2檢驗，分析供試大白菜材料根腫病抗性遺傳規(guī)律。

圖1 人工接種抗性鑒定分級標準Fig.1 Artificial inoculation identification classification standard

1.2.3 大白菜基因組DNA提取和質(zhì)量檢測 使用CTAB法[16]提取親本、F1和F2大白菜植株葉片的基因組DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳(電泳緩沖液為1×TAE)檢測提取大白菜基因組DNA的質(zhì)量，最后用蒸餾水將DNA原液稀釋到50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR反應體系與抗根腫病基因連鎖標記的篩選 本試驗采用10 μL的PCR反應體系：基因組DNA(50 ng/μL)1 μL，正向引物(10 μmol/L)0.4 μL，反向引物(10 μmol/L)0.4 μL，PCR Mix(10 μg/mL) 5 μL，ddH2O 3.2 μL，總體積10 μL。

取基因組DNA樣品1 μL進行PCR擴增。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。最后將擴增產(chǎn)物4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，快速銀染法染色檢測、照膠保存，統(tǒng)計多態(tài)性條帶。

1.2.5 遺傳圖譜的構(gòu)建與抗病基因的定位 整理統(tǒng)計所有分子標記在親本、F1和F2單株中的擴增條帶類型，篩選出連鎖標記。根據(jù)單株抗病性表型和單株分子標記的基因型鑒定結(jié)果，利用JoinMap 4.0軟件分析目的基因和分子標記的連鎖關(guān)系，進行基因定位，設置LOD值為3.0，構(gòu)建連鎖圖譜。

1.2.6 新定位抗根腫基因位點與Crr1的對比 由于新定位抗根腫基因位點與Crr1均位于A08染色體上，為驗證二者是否為同一位點，同時在已有研究基礎上，開發(fā)Crr1基因的多態(tài)性分子標記，筆者根據(jù)文獻報道中Crr1基因的定位區(qū)間，對供試大白菜抗、感親本材料Crr1基因定位區(qū)間內(nèi)序列進行測序，比對測序結(jié)果(圖2)，同時結(jié)合大白菜數(shù)據(jù)庫(http：//brassicadb.org/brad/)基因組信息，在序列差異區(qū)域使用Primer 5.0軟件設計了6對新的InDel分子標記(表1)，并在F2群體中進行驗證，繪制連鎖圖譜，篩選新的多態(tài)性標記，并分析新標記與新定位位點間的位置關(guān)系。

圖2 抗、感親本材料定位區(qū)域部分序列比對結(jié)果Fig.2 Resistance and susceptible parental material localization region partial sequence alignment result

引物名稱 Primer name上游引物序列Upstream primer base sequence下游引物序列Downstream primer base sequenceBrID10378TGTGGGAAGGAAATAAAGTAAGTACATCCATCCACTTGAGATTTCTAATCBrID10379GAGCTCCTAATGGAAATAAAAATGACATTAAGAAAAAGACGATCCTCAGCBrID10380CTCAAGCTGTGCTCAAGCCTTATGGCTTGAGATTGGTCATATTTCCAATABrID10381TTCTCAAGATTAGTCATATTACTAAGGATGTTCAAGTCTTATGGAGCTTCBrID10382ACTTGTAATCAATGGATGCACAAAGAACTTTGTCCTGTAAAAAGAGCABrID10383CGATTCAGTTTGAGGCAGTTAACAAACTTGTAATCAATGGATGCACAAAG

2 結(jié)果與分析

2.1 根腫病抗性鑒定結(jié)果和遺傳學分析

圖3 感病、抗病親本及F1抗病性鑒定結(jié)果Fig.3 The parents，F(xiàn)1 generation of disease resistance identification result

圖4 F2群體部分單株抗病性鑒定結(jié)果Fig.4 Part of the plants in F2 populations result

2.2 分子標記篩選與抗根腫病基因定位

本研究先利用抗、感親本和F1對文獻中已經(jīng)發(fā)表的與大白菜抗根腫病基因緊密連鎖的29對分子標記，王艷[9]報道的均勻分布在大白菜10條染色體上的415對InDel標記和92對SSR標記，以及大白菜基因組數(shù)據(jù)庫中的144對SSR引物標記進行多態(tài)性篩選，得到分布在10條染色體上的83對存在多態(tài)性的分子標記(圖5)。

在F2群體中挑選24株極抗和24株極感單株組成48株極端表型群體，將83對多態(tài)性標記在48株極端表型群體中進行驗證，對得到的連鎖標記再進一步擴大F2群體進行驗證，結(jié)果得到2個與抗病基因連鎖的InDel分子標記(圖6)，分別為BrID10727和BrID10427，這2個分子標記都位于A08染色體上，初步判定試驗材料所含抗根腫病基因位于大白菜A08染色體上。

查閱文獻，尋找A08染色體上與抗病基因連鎖的分子標記，經(jīng)過在雙親和F1間進行多態(tài)性篩選和在F2群體中的進一步驗證，又得到了3個與抗根腫基因連鎖的InDel標記，分別為BrID10867、BrID11507和BrID11233，利用JoinMap 4.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜(圖7)。

箭頭所指為多態(tài)性分子標記的引物擴增條帶。The arrow indicates the polymorphism marker amplified bands.

圖6 多態(tài)性分子標記BrID10427在48株極端表型群體間的檢測結(jié)果Fig.6 Polymorphism markers BrID10427 between 48 extreme phenotypic groups test result

圖7 多態(tài)性分子標記在遺傳圖譜和物理圖譜中的位置Fig.7 The location of polymorphic molecular markers in genetic maps and physical maps

結(jié)果顯示，抗病基因被定位在BrID10727-BrID10867，與抗病基因的遺傳距離分別為4.6，2.5 cM，通過將這2個標記的上下游引物序列與大白菜基因組序列信息進行比對后發(fā)現(xiàn)，這2個分子標記之間的物理區(qū)間為0.43～6.48 Mb。其余3個分子標記BrID11233、BrID10427和BrID11507與CR基因的遺傳距離分別為3.1，5.8，8.1 cM，且都和BrID10867位于一側(cè)。

2.3 新定位抗根腫基因位點與Crr1的對比

重復2.2中的步驟，將基于Crr1基因序列新設計的6個InDel標記在F2群體中進行篩選驗證，獲得1個與抗病基因連鎖的多態(tài)性分子標記，即BrID10381(圖8)。利用JoinMap 4.0分析數(shù)據(jù)并繪制遺傳連鎖圖譜(圖9)。結(jié)果顯示，基于Crr1基因序列開發(fā)的InDel標記BrID10381與新定位抗根腫病基因位點的遺傳距離為6.5 cM，該標記在物理圖中的位置為11.61 Mb，在新定位抗根腫基因初定位區(qū)間的外側(cè)，因此，可以推斷新定位抗根腫基因位點與Crr1并非同一位點。

圖8 新設計標記BrID10381在48株極端表型群體間的檢測結(jié)果Fig.8 New design marker BrID10381 between 48 extreme phenotypic groups test result

圖9 標記BrID10381在遺傳圖譜和物理圖譜中的位置Fig.9 The location of BrID10381 in genetic maps and physical maps

3 結(jié)論與討論

本研究采用人工接種鑒定的方法對供試抗、感親本材料、F1和F2群體進行了根腫病抗性鑒定，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，本試驗材料中的根腫病抗性受顯性單基因控制，與前人研究結(jié)果一致，Suwabe等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大多用于研究的大白菜抗病材料中，根腫病抗性均是受單個顯性主效基因控制，只有G004這一抗病材料中根腫病抗性是數(shù)量遺傳，受多基因控制。

本研究將抗根腫病基因初步定位在了大白菜A08染色體上6.05 Mb范圍內(nèi)，2個側(cè)翼分子標記的物理位置分別為0.43，6.48 Mb。已報道的8個抗根腫病基因分別被定位在5條染色體上，其中位于A08上的基因有一個，為Crr1[18-23]。雖然本研究中的抗根腫病基因與Crr1同樣位于A08上，但與Crr1緊密連鎖的SSR分子標記BRMS-088[24-25]在本研究供試群體中驗證后不具有多態(tài)性，且經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)，基于Crr1基因序列新開發(fā)的標記BrID10381在物理圖中的位置為11.61 Mb，不在新定位抗根腫基因初定位區(qū)間內(nèi)，因此，可以推斷新定位抗根腫基因位點與Crr1并非同一位點，同時基于Crr1基因序列新開發(fā)的標記BrID10381具有多態(tài)性，與BRMS-088相比可以用于Crr1基因的分子標記輔助選擇，在大白菜抗根腫病育種實踐中具有很大的應用價值。

本研究結(jié)果為下一步該抗病基因的精細定位和基因克隆以及分子標記輔助選擇(MAS)育種奠定了基礎，有助于未來大白菜抗根腫病新品種的選育。