蘇 怡，任啟智，劉玉文，白 晶，苑洪菲

(1.黑龍江省疾病預(yù)防控制中心,哈爾濱 150030；2. 哈爾濱市南崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心,哈爾濱 150008； 3.武警黑龍江省總隊(duì)醫(yī)院 婦產(chǎn)科,哈爾濱 150076)

細(xì)菌感染性腹瀉是一種常見的腸道傳染病，發(fā)病率高居全球傳染病第三位，是我國急性傳染病中發(fā)病數(shù)最多、流行面最廣、影響群眾生活最普遍的一組疾病。細(xì)菌感染性腹瀉的致病菌種類復(fù)雜，人群普遍易感，增加了預(yù)防和控制細(xì)菌感染性腹瀉的難度[1]。為了解黑龍江省細(xì)菌性腹瀉病原譜構(gòu)成，探討主要病原體的變異和流行變遷規(guī)律，提高監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室腹瀉病原實(shí)驗(yàn)室診斷、監(jiān)測預(yù)警、突發(fā)腹瀉疫情的處置能力，為進(jìn)一步防治工作提供科學(xué)依據(jù)；結(jié)合國家科技重大項(xiàng)目“傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺(tái)項(xiàng)目”《腹瀉病癥候群監(jiān)測技術(shù)方案》管理手冊的要求，及時(shí)采集哨點(diǎn)醫(yī)院腸道門診的細(xì)菌感染性腹瀉患者糞便，采用分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清分型的方法，進(jìn)行沙門氏菌、志賀氏菌、致瀉大腸桿菌等腸道致病菌的檢測工作，并對2009年1月～2012年6月病原菌檢測及其結(jié)果進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

標(biāo)本來自黑龍江省腹瀉癥候群監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院腸道門診，采集時(shí)間為2009年1月～2012年6月，選擇每日腹瀉≥3次，且有大便性狀改變(呈稀便，水樣便，粘膿便或膿血便等)的病例。監(jiān)測點(diǎn)腸道門診用5支棉簽采集糞便標(biāo)本置于Carry-Blair培養(yǎng)基中，4 ℃冷藏保存，24 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2 方法

按照國家科技重大項(xiàng)目《腹瀉病癥候群監(jiān)測技術(shù)方案》[2]中的方法進(jìn)行檢測，包括致瀉大腸桿菌DiarrheogenicEscherichiacoli、沙門氏菌Salmonella、志賀氏菌Shigella、小腸耶爾森氏菌Versiniaenterocolitica、弧菌Vibrio(霍亂弧菌Vibriocholerae、副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus)、氣單胞菌Aeromonas、類志賀鄰單胞菌Plesiomonasshigelloides等菌屬。所有分離的陽性菌株均送到黑龍江省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行復(fù)檢確認(rèn)。

1.2.1 增菌

在裝有標(biāo)本的Carry-Blair培養(yǎng)基中，取一棉簽標(biāo)本置于改良磷酸鹽緩沖液中，4 ℃增菌20 d。另取棉簽標(biāo)本，分別放入堿性蛋白胨水(APW)，mEC和SBG增菌液中，37 ℃分別增菌培養(yǎng)6 h、14 h和16 h。取第五支棉簽直接接種到Mac、SS、XLD培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，以及接種到Karmali培養(yǎng)基上，42 ℃微需氧培養(yǎng)2～3 d觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 分離培養(yǎng)

將磷酸鹽緩沖液接種到耶爾森氏菌選擇性平板和Mac培養(yǎng)基中，25±1 ℃培養(yǎng)24 h。自APW增菌液，選擇生長最茂盛的培養(yǎng)基表面或菌膜下表層，取2～3滴加入霍亂O1、O139膠體金試紙中，同時(shí)劃線接種TCBS瓊脂、慶大瓊脂、科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～18 h后，從慶大瓊脂上選擇5～10個(gè)可疑菌落做霍亂弧菌血清凝集實(shí)驗(yàn)；從TCBS瓊脂、科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上選擇5～10個(gè)單個(gè)菌落，做其他弧菌鑒定試驗(yàn)；從Mac、SS、XLD平板上選取單菌落做氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌和其他弧菌鑒定試驗(yàn)；將mEC和SBG增菌液分別接種到O157顯色培養(yǎng)基和沙門氏顯色培養(yǎng)基，36±1 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 生化及血清學(xué)檢測

自TCBS、科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基、Mac、SS、XLD和耶爾森氏菌選擇性平板等分離平板上挑取可疑菌落接種于KIA/MIU，做氧化酶實(shí)驗(yàn)；用API20E進(jìn)行生化初篩；志賀菌、沙門氏菌及致瀉大腸桿菌做血清凝集試驗(yàn)進(jìn)行分型；對Karmali培養(yǎng)基上的可疑菌落做氧化酶、觸媒和馬尿酸鹽水解實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有符合病例定義要求的患者的個(gè)人信息及其便樣檢測結(jié)果，均由專人錄入傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺(tái)信息系統(tǒng)，數(shù)據(jù)分析時(shí)直接由系統(tǒng)Excel中導(dǎo)出，計(jì)算各種檢出率。對率進(jìn)行用卡方顯著性檢驗(yàn)和方差分析，統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS19.0，檢驗(yàn)水平為 α=0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 不同性別患者病原菌的檢出

537份腹瀉樣品中男性患者351人，女性患者186人，197株陽性菌株中男性有129例，女性有68例。病原菌檢出率，男性為36.75%，女性為36.56%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.002，P=0.964 33，P>0.05)，男女患病的機(jī)率沒有差別(見表1)。

表1 不同性別病原菌檢出情況Table 1 Detection of pathogens of different genders

2.2 不同年齡組病原菌的檢出

不同年齡組病原菌的檢出率分別為：0～10歲為42.72%(182/426)，11～20歲為10.00%(2/20)，21～30歲為13.33%(2/15)，30～40歲為16.67%(2/12)，40～50歲為19.05%(4/21)，50～60歲為15.38%(2/13)，60～70歲為11.11%(1/9)，70歲以上為9.527%(2/21)，各年齡組病原菌檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.776，P=0.01302，P<0.05 )，其中0～10歲年齡組患病人數(shù)和檢出率均高于其他年齡組，可能與各個(gè)年齡組人群的感染機(jī)會(huì)和自身免疫力有關(guān)(見表2)。

表 2 不同年齡病原菌的檢出情況Table 2 Detection of pathogens at different ages

2.3 不同月份病原菌的檢出

細(xì)菌感染性腹瀉患者全年均有發(fā)病，各月份病原菌檢出率如下：1月份為11.11%(1/9)，2月份為0%(0/7),3月份為20%(1/5),4月份為10%(1/10),5月份為20.41%(10/19)，6月份為29.46%(33/112)，7月份為43.30%(42/97)，8月份為41.54%(54/130)，9月份為86.54%(45/52)，10月份為14.29%(4/28)，11月份為14.29%(4/28)，12月份為20%(2/10)；各月病原菌檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=40.464，P=0.00001，P<0.05)，病原菌檢出率存在季節(jié)性差異，高發(fā)月份為6～9月，低檢出月份為12月至翌年1～4月(見表 3)。

2.4 病原菌的檢出和構(gòu)成

2009年1月～2012年6月檢測細(xì)菌感染性腹瀉群患者標(biāo)本537份，檢出率為36.69%(197/537)，其中致瀉性大腸桿菌5株(9.31%)，志賀氏菌37株(6.89%)，副溶血弧菌7株(1.30%)，沙門氏菌18株(3.35%)，類志賀鄰單胞菌3株(0.56%)，嗜水氣單胞菌1株(0.19%)，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌2株(0.37%)，霍亂弧菌4株(0.74%)，空腸彎曲菌29株(5.40%)，大腸埃希氏菌91株(16.95%)；各致病菌比例關(guān)系如圖1所示，檢出病原菌占前四位的是：大腸埃希氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和沙門氏菌。

表3 不同月份病原菌檢出情況Table 3 Detection of pathogens in different months

圖1 各致病菌比例關(guān)Fig.1 Propotion relations of each pathogenic bacteria

3 討 論

3.1 人群分布

腹瀉患者男女比例1.89∶1，男性病原菌檢出率36.75%(129/351)，女性36.56%(68/186)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，人群普遍易感，沒有性別差異[3-4]。患病人數(shù)以少年兒童為多，說明兒童由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善更易感染，病情較重。另外，成人腹瀉癥狀輕，病程短，且采樣配合度較低，故成人病例相對較少，與某市的報(bào)道相一致[5-7]。

3.2 時(shí)間分布

病例主要集中在5～9月的夏、秋兩季，符合感染性腹瀉的流行病學(xué)規(guī)律[8-11]。夏、秋季氣溫較高，有利于各種病原菌的繁殖、蠅蟲的滋生，導(dǎo)致食物變質(zhì)、水源污染，人群感染機(jī)會(huì)增多。黑龍江省冬季時(shí)間較長，氣候寒冷，不適于細(xì)菌病原菌的繁殖和傳播，感染機(jī)會(huì)下降。

3.3 病原菌分布

細(xì)菌感染性腹瀉是由多種病原體引起的腸道傳染病，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示檢出的致病菌種類復(fù)雜，以大腸埃希氏菌為第一位，其次為志賀菌、空腸彎曲菌和沙門菌，致瀉性弧菌檢出的比例也較大，與相關(guān)的報(bào)道相一致[12-13]。水產(chǎn)品中常常攜帶大量的致瀉性弧菌，夏秋季節(jié)大量水產(chǎn)品上市。如水產(chǎn)品生食或加工不當(dāng)，易造成細(xì)菌性腹瀉病的發(fā)生，故除加強(qiáng)監(jiān)測外，應(yīng)對市民進(jìn)行相關(guān)知識(shí)的宣傳和培訓(xùn)，以減少食源性疾病的發(fā)生，保障市民的身體健康。

3.4 進(jìn)一步探索

隨著科學(xué)的發(fā)展，檢測技術(shù)的提升，目前分子生物學(xué)技術(shù)經(jīng)歷大膽的科學(xué)假說、經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究、建立該學(xué)科的理論基礎(chǔ)，目前的應(yīng)用已經(jīng)覆蓋到各個(gè)研究領(lǐng)域。我們今后有待于把經(jīng)典的生物學(xué)方法與先進(jìn)的分子生物學(xué)方法完美結(jié)合，把所分離的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，進(jìn)一步分析，為基因診斷和基因治療提供更多科學(xué)依據(jù)。

3.5 防治和控制

腹瀉病是迄今全球性重要的公共衛(wèi)生問題之一，中國是一個(gè)發(fā)展中國家，幅員遼闊，人口眾多，各地發(fā)展又極不平衡，這給腹瀉病的預(yù)防和控制帶來很大的困難。我們應(yīng)針對本地區(qū)腹瀉癥候群的發(fā)病情況與流行特征，加強(qiáng)腹瀉癥候群病人、水源及水產(chǎn)品的監(jiān)測是至關(guān)重要的；為進(jìn)一步做好腹瀉癥候群的防治工作，必須控制傳染源，以切斷傳播途徑為主；大力加強(qiáng)腹瀉病防治知識(shí)的宣傳教育工作，改善衛(wèi)生條件，提高群眾衛(wèi)生意識(shí)，養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣。切實(shí)降低本地區(qū)的腹瀉發(fā)病率，為創(chuàng)建健康文明城區(qū)、促進(jìn)社會(huì)和諧發(fā)展奠定基礎(chǔ)。[14]