李 滾，張 濤，楊鑫榮，盧香香

(西安工業(yè)大學(xué) 電子信息工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，西安 710021)

乙肝病毒屬于DNA病毒，具有嗜肝性，該病毒感染會(huì)演變成肝炎甚至發(fā)展成肝硬化，相關(guān)疾病給患者及其家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。乙肝病毒是一個(gè)相當(dāng)小的病毒，成環(huán)狀、部分為雙鏈DNA。乙肝病毒編碼的幾種蛋白中S蛋白是病毒的包膜蛋白，與病毒進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)，吸引了眾多學(xué)者關(guān)注[1-2]。乙肝病毒S蛋白由226個(gè)氨基酸組成，屬于疏水蛋白質(zhì)[3]。乙肝病毒S蛋白是乙肝病毒亞病毒顆粒的主要組成部分，它的數(shù)量遠(yuǎn)比乙肝病毒顆粒多。以往研究者曾用生物信息學(xué)方法逐一對(duì)乙肝病毒基因區(qū)段的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系進(jìn)行分析，不僅證明了乙肝病毒中部分功能區(qū)域的性質(zhì)，而且發(fā)現(xiàn)了包膜蛋白上潛在的新功能域[4]。乙肝病毒大蛋白由S、PreS2和PreS1基因編碼的HBsAg、PreS2和PreS1共同構(gòu)成，已有部分研究證實(shí)乙肝病毒S大蛋白能夠激活基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，促進(jìn)肝癌發(fā)生，然而乙肝病毒S大蛋白在肝癌形成過(guò)程中所發(fā)揮的作用依然有很多問(wèn)題有待研究?，F(xiàn)有的乙肝免疫球蛋白都是針對(duì)乙肝病毒S蛋白的免疫球蛋白。和通過(guò)血液提純的免疫球蛋白途徑相比，單克隆抗體靶點(diǎn)清晰，靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，同時(shí)，抗體的特異性結(jié)合能力和中和病毒的能力是評(píng)價(jià)中和抗體的關(guān)鍵指標(biāo)。對(duì)乙肝病毒S蛋白進(jìn)行深入研究有利于乙肝病毒的預(yù)防、診斷以及表位疫苗的研制[5]。本論文利用生物信息學(xué)方法分析乙肝病毒S蛋白的序列特征和抗原表位，預(yù)測(cè)該蛋白的抗原性，為進(jìn)一步研究S蛋白結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能提供參考依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

登陸NCBI網(wǎng)站，從GenBank(NIH遺傳序列數(shù)據(jù)庫(kù))數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取乙肝病毒S蛋白氨基酸序列(檢索號(hào)：ATY75544.1)。

1.2 方法

利用https://web.expasy.org/protparam/ 網(wǎng)站統(tǒng)計(jì)與計(jì)算乙肝病毒S蛋白序列組成；利用https://web.expasy.org/protparam/網(wǎng)站分析乙肝病毒S蛋白的親水性(疏水性)；利用https://npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page= npsa_ sopma. html網(wǎng)站分析乙肝病毒S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網(wǎng)站分析乙肝病毒S蛋白的信號(hào)肽特征；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網(wǎng)站分析乙肝病毒S蛋白的跨膜區(qū)；利用http://tools.immuneepitope.org/bcell 網(wǎng)站預(yù)測(cè)乙肝病毒S蛋白最佳抗原表位形成位置；利用http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/網(wǎng)站分析乙肝病毒S蛋白的磷酸化位點(diǎn)[6]。并將上述各預(yù)測(cè)的數(shù)值化結(jié)果進(jìn)行重新繪圖并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙肝病毒S蛋白序列的基本組成成分

乙肝病毒S蛋白由226個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量單位(Mr)為25 387.14。如圖1所示，圖中縱坐標(biāo)表示不同的氨基酸，226個(gè)氨基酸中亮氨酸(Leu)、絲氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、蘇氨酸(Thr)含量較高，分別占氨基酸總數(shù)的35%、25%、22%、19%。脂肪系數(shù)是99.60。理論等電點(diǎn)是8.21，原子總數(shù)是3 569。帶負(fù)電荷殘基的Asp(天冬氨酸)和Glu(谷氨酸)的數(shù)目是27，帶正電荷殘基的Arg(精氨酸)和Lys(賴氨酸)的總數(shù)目是18。N端的蛋白的為Met，S蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)是59.66，預(yù)測(cè)S蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。乙肝病毒S蛋白的半衰期在體外的哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞內(nèi)是30 h，在酵母體內(nèi)大于20 h，在大腸桿菌內(nèi)大于10 h。

2.2 乙肝病毒S蛋白的親水性(疏水性)

乙肝病毒S蛋白的總平均親水性為0.649，可能是疏水蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的組成成分氨基酸的側(cè)鏈大部分或者全部由碳原子和氫原子組成，不太可能與水分子形成氫鍵。圖2疏水性的測(cè)試結(jié)果集中反映了不同氨基酸位置的親疏水性分布情況，閾值線為0，閾值線以上部分的氨基酸殘基表現(xiàn)為疏水性，閾值線以下部分的氨基酸殘基表現(xiàn)為親水性?？梢钥闯鲈?130-170)和(190-210)位置為高疏水值區(qū)域，附近可能存在潛在跨膜區(qū)。

圖2 S蛋白疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 Hydrophobicity prediction results for S protein

2.3 乙肝病毒S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中的氨基酸的組成和排列順序決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其功能的影響較大，蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)是確定抗原表位，即確定抗原抗體結(jié)合部位的一種輔助手段[35]。乙肝病毒的S蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3，其中藍(lán)色表示α螺旋，有72處氨基酸為α螺旋約占二級(jí)結(jié)構(gòu)總數(shù)的31.86%；綠色表示β轉(zhuǎn)角，有17處氨基酸為β轉(zhuǎn)角約占二級(jí)結(jié)構(gòu)總數(shù)的7.52%；紅色表示β折疊，有44處氨基酸為β折疊約占二級(jí)結(jié)構(gòu)總數(shù)的19.47%；紫色表示無(wú)規(guī)則卷曲，有93處氨基酸為無(wú)規(guī)則卷曲約占二級(jí)結(jié)構(gòu)總數(shù)的41.15%。由β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲組成的區(qū)域占48.67%，表明在乙肝病毒 S蛋白的這些區(qū)域中，抗原表位容易產(chǎn)生[7]。(彩圖見(jiàn)電子版：http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx.2019年第2期)。

圖3 S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of S protein

2.4 乙肝病毒S蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)及磷酸化位點(diǎn)分析

信號(hào)肽的本質(zhì)是一段氨基酸序列，一般位于多肽鏈的末端，在蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起作用。如圖4所示，S經(jīng)常被用于預(yù)測(cè)信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)[8]，該預(yù)測(cè)結(jié)果中S分值最大為0.606，大于信號(hào)肽閾值0.5，S分值與閾值線的交點(diǎn)處的氨基酸位點(diǎn)為5，說(shuō)明乙肝病毒S蛋白存在信號(hào)肽。且信號(hào)肽長(zhǎng)度為5個(gè)氨基酸殘基，該蛋白的剪切部位在5-6氨基酸處。5氨基酸之后S分值較小這部分蛋白為成熟蛋白。

圖4 S蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Signal peptide prediction results for S protein

跨膜區(qū)是指蛋白質(zhì)氨基酸序列中跨越細(xì)胞膜的區(qū)域。如圖5所示，藍(lán)色表示細(xì)胞膜內(nèi)，綠色表示細(xì)胞膜外，紅色部分表示跨膜區(qū)。乙肝病毒S蛋白存在4個(gè)跨膜區(qū)位置分別是7-29，80-98，170-192，202-224。(彩圖見(jiàn)電子版：http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx.2019年第2期)。

圖5 乙肝病毒S蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Transmembrane region prediction results of S protein

如圖6所示，紅色表示絲氨酸，綠色表示蘇氨酸，藍(lán)色表示酪氨酸。乙肝病毒S蛋白存在7個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，22個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，表明乙肝病毒S蛋白有30個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。(彩圖見(jiàn)電子版：http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx.2019年第2期)。

圖6 乙肝病毒S蛋白磷酸化位點(diǎn)Fig.6 Phosphorylation site of S protein in hepatitis B virus

2.5 乙肝病毒S蛋白最佳抗原表位位置預(yù)測(cè)

對(duì)乙肝病毒S蛋白進(jìn)行可及性分析，可及性分析集中體現(xiàn)了乙肝病毒S蛋白抗原中氨基酸殘基的分布情況?？杉靶栽酱笳f(shuō)明相應(yīng)的氨基酸殘基更容易與抗體結(jié)合。如圖7所示，閾值線以上均為S蛋白抗原中氨基酸殘基可被溶劑分子接觸的部分，得分較高的氨基酸區(qū)域有10個(gè)分別為：0-3、24-34、48-62、66-69、96-99、109-118、122-132、139-143、165-168、198-204。

圖7 乙肝病毒S蛋白可及性Fig.7 Accessibility of S protein in hepatitis B virus

對(duì)乙肝病毒S蛋白進(jìn)行線性表位分析，線性表位預(yù)測(cè)對(duì)于多種免疫研究是必不可少的，選擇有效的線性表位有利于順利進(jìn)行抗體制備。如圖8所示，黃色部分即閾值線以上部分的線性表位對(duì)應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)較為適合作為抗原抗體結(jié)合部位，得分高的閾值線以上區(qū)域有7個(gè)分別為：0-8、25-36、46-69、100-155、165-168、182-188、200-206。(彩圖見(jiàn)電子版：http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx.2019年第2期)。

圖8 乙肝病毒S蛋白線性表位Fig.8 Linear epitope of S protein in hepatitis B virus

對(duì)乙肝病毒S蛋白進(jìn)行β轉(zhuǎn)角結(jié)果預(yù)測(cè)，β轉(zhuǎn)角一般處于蛋白質(zhì)表面位置，為凸出結(jié)構(gòu)，經(jīng)常發(fā)生扭曲結(jié)構(gòu)較為松散，更容易與抗體結(jié)合，由于β轉(zhuǎn)角中的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性的特殊性，使得β轉(zhuǎn)角存在區(qū)域易形成抗原表位。本論文的抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果中閾值為1。如圖9所示，得分高的區(qū)域即閾值線以上的綠色區(qū)域有6個(gè)分別為：0-6、27-34、37-39、47-70、102-153、195-204。

圖9 S蛋白β轉(zhuǎn)角預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.9 β angle prediction results for S protein

對(duì)乙肝病毒S蛋白進(jìn)行抗原性與分子量、化學(xué)組成、立體結(jié)構(gòu)有關(guān)?？乖栽酱?，對(duì)應(yīng)的氨基酸越穩(wěn)定，越容易形成抗原位點(diǎn)。圖10為對(duì)乙肝病毒S蛋白進(jìn)行抗原性結(jié)果預(yù)測(cè)的結(jié)果，得分較高的綠色閾值線以上區(qū)域有10個(gè)分別為：9-19、43-49、63-69、76-99、103-108、132-138、146-151、172-184、187-191、200-224。綜合分析乙肝病毒S蛋白的可及性、線性表位、β轉(zhuǎn)角、柔性、抗原性得到的潛在抗原表位有2個(gè)區(qū)域，分別為：48-49、66-69。

圖10 乙肝病毒S蛋白抗原性Fig.10 Antigenicity of S protein in hepatitis B virus

3 討 論

抗原表位是指位于抗原分子中的一種特殊的化學(xué)基團(tuán)，對(duì)抗原特異性起決定性作用，抗原通過(guò)抗原表位完成免疫效應(yīng)。表位疫苗是一種新型疫苗，在艾滋病等病毒上已經(jīng)取得了初步研究進(jìn)展。表位疫苗是指通過(guò)基因工程的手段，體外培養(yǎng)或人工合成微生物的表位，將得到的表位作為一種疫苗使用[9]。與傳統(tǒng)疫苗相比，表位疫苗更加穩(wěn)定安全[10]。為了提高抗原表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，基于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)乙肝病毒S蛋白的可及性、線性表位、β轉(zhuǎn)角、抗原性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，選出利用不同性質(zhì)分析結(jié)果中相同區(qū)域，作為最佳抗原表位位置，綜合分析得到的潛在抗原表位有2個(gè)區(qū)域，分別為：48-49、66-69。

乙型肝炎由乙型肝炎病毒引發(fā)，是一種全球性疾病，全世界乙型肝炎的慢性感染者約有4億人。因?yàn)橐倚透窝孜：O大，流傳廣，因此各國(guó)科學(xué)家對(duì)乙肝病毒的防治方法給予了高度的重視[11]。乙肝病毒頑強(qiáng)的抵抗力和潛伏性是乙肝病毒難以治愈的主要原因。蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)是生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[12]。自1965年乙肝病毒被發(fā)現(xiàn)就一直是一項(xiàng)難以攻克的難題，在現(xiàn)今的醫(yī)療水平上乙肝病毒幾乎可以說(shuō)是一種可以被控制，但不能被徹底殺死的病毒。乙肝病毒S蛋白在人體內(nèi)的不僅會(huì)對(duì)肝臟造成傷害，還會(huì)通過(guò)影響男性患者的精子存活率以及受精能力導(dǎo)致生育能力下降[13]。關(guān)于乙肝病毒S蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果，是基于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)以及計(jì)算機(jī)分析得到的。這些預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)深入研究乙肝病毒、表位疫苗的研制具有指導(dǎo)意義，但還不能完全照搬，必須設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，才能真正應(yīng)用于乙肝病毒的防治過(guò)程。

李晉濤等人預(yù)測(cè)了一種抑制蛋白的表面特性和二級(jí)結(jié)構(gòu)，采取多參數(shù)分析法進(jìn)行預(yù)測(cè)，如對(duì)可塑性和親水性、免疫原性和理化性質(zhì)等方面進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該抑制蛋白存在多個(gè)潛在的抗原表位[14]。黃繼華采用多種方法檢測(cè)乙肝病毒S蛋白對(duì)人精子凋亡和受精能力的影響，結(jié)果證明乙肝病毒S蛋白在精子的凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用，因此精子的線粒體的部分功能甚至于受精能力都會(huì)受到不同程度的影響[15]。丁悅等人的系列 研究表明乙肝病毒的主要構(gòu)成成分乙肝病毒S蛋白能夠引起精子線粒體膜電位、精子活力、受精能力顯著下降，并導(dǎo)致精子大量死亡。同時(shí)，乙肝病毒S蛋白還可引起人精子產(chǎn)生氧化應(yīng)激影響細(xì)胞膜的完整性，并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而影響精子的功能[16]。本研究對(duì)乙肝病毒S蛋白運(yùn)用生物信息學(xué)知識(shí)進(jìn)行序列特征分析，成功預(yù)測(cè)到S蛋白的基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能特征以及潛在的抗原表位所在位置，這些數(shù)據(jù)在一定程度上將作為對(duì)乙肝病毒以及乙肝病毒S蛋白深入研究和表位疫苗研制、免疫診斷的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

乙肝病毒存在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程并且具有極強(qiáng)的潛伏性。應(yīng)用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站進(jìn)行乙肝病毒S蛋白的序列特征分析，并在分析的基礎(chǔ)上研究乙肝病毒S蛋白的生物學(xué)特性。研究結(jié)果顯示：(1)乙肝病毒S蛋白是不穩(wěn)定蛋白，很難與水分子形成氫鍵屬于疏水蛋白質(zhì)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲占大多數(shù)，同時(shí)乙肝病毒S蛋白存在信號(hào)肽、跨膜區(qū)以及潛在的磷酸化位點(diǎn)。(2)結(jié)合乙肝病毒S蛋白的序列可及性、線性表位、β轉(zhuǎn)角、柔性、抗原性的預(yù)測(cè)結(jié)果，可以找到最合適的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行抗原抗體結(jié)合，形成抗原表位，綜合分析得到的潛在抗原表位有2個(gè)區(qū)域，分別為：48-49、66-69。研究結(jié)果可以作為表位疫苗的研制依據(jù)，有利于進(jìn)一步研究乙肝病毒S蛋白的抗原性，對(duì)乙肝病毒S蛋白的研究進(jìn)展有促進(jìn)作用。