陳悅，王田幸子，楊爍，張彤，馬金姣，燕高偉，劉玉晴，周艷，史佳楠，蘭金蘋，魏健，竇世娟，劉麗娟，楊明，李莉云，劉國(guó)振

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001）

0 引言

【研究意義】在高等植物中廣泛存在 WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其核心序列由60個(gè)氨基酸殘基組成，最為保守的序列是WRKYGQK，WRKY之名也由此得來(lái)[1]。全基因組序列分析表明，水稻品種日本晴（粳稻）中有98個(gè)WRKY成員，9311（秈稻）中有102個(gè)WRKY成員[2]。根據(jù)基因符號(hào)、命名和連鎖關(guān)系委員會(huì)（The Committee on Gene Symbolization，Nomenclature and Linkage，CGSNL）的建議，每個(gè)水稻W(wǎng)RKY基因成員都有特定的編號(hào)或名稱[3]。水稻W(wǎng)RKY成員的功能研究對(duì)了解水稻的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病抗逆機(jī)理等具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，但每一個(gè) WRKY成員的功能并不相同，它們作為轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控不同的生物學(xué)過(guò)程，所以需要逐個(gè)調(diào)查，才能對(duì) WRKY家族整體有完整的了解?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】超表達(dá)水稻OsWRKY11的植株呈現(xiàn)卷葉表型、抽穗時(shí)間晚于對(duì)照[4]，OsWRKY11在干旱和病原菌侵染中也發(fā)揮作用[5]。超表達(dá)OsWRKY13的水稻開(kāi)花時(shí)間延遲、株高降低[6]，對(duì)高鹽脅迫更為敏感[6-7]，對(duì)白葉枯病和稻瘟病的抗性提高[8]。超表達(dá)OsWRKY22提高了水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性[9]。OsWRKY28的超表達(dá)使水稻更易感稻瘟病[10]。超表達(dá)OsWRKY30提高了水稻對(duì)稻瘟病和紋枯病的抗性[11]及抗旱性[12]。超表達(dá)OsWRKY55的水稻側(cè)根數(shù)目減少，稻瘟病抗性提高[13]。超表達(dá)OsWRKY42的水稻表現(xiàn)為葉片早衰，并伴隨著活性氧積累和葉綠素下降[14]，在擬南芥中超表達(dá)OsWRKY42提高了其耐鹽能力[15]。超表達(dá)OsWRKY45提高了水稻對(duì)白葉枯病和稻瘟病的抗性[16-17]，在水稻-稻瘟病菌互作過(guò)程中，OsWRKY45-2轉(zhuǎn)錄激活OsWRKY13，OsWRKY13可以抑制OsWRKY42，而OsWRKY42通過(guò)抑制茉莉酸（jasmonate acid，JA）途徑相關(guān)基因，負(fù)調(diào)控水稻抗稻瘟病的抗性[18]。OsWRKY45的轉(zhuǎn)錄水平受脫落酸（abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、NaCl、PEG、甘露醇（mannitol）、干旱、0℃和42℃等處理誘導(dǎo)[17-19]。此外，還有報(bào)道表明，OsWRKY45能促進(jìn)水稻產(chǎn)量的提高[20]。超表達(dá)OsWRKY47提高了水稻對(duì)稻瘟病的抗性[21]，對(duì)OsWRKY47的超表達(dá)和敲除試驗(yàn)證明該基因是水分脅迫的負(fù)調(diào)控因子[22]。OsWRKY53是油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids，BR）信號(hào)的正調(diào)控因子，超表達(dá)使水稻葉傾角增大，種子增大，而敲除植株表現(xiàn)出葉傾角變小，種子變小，株高變矮[23]，超表達(dá)OsWRKY53提高了水稻對(duì)稻瘟病的抗性[24]。超表達(dá)OsWRKY62的水稻對(duì)白葉枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo）的抗性下降[25]。OsWRKY67[26]和OsWRKY71[27]正調(diào)控Xa21介導(dǎo)的白葉枯病抗性。在擬南芥中超表達(dá)OsWRKY72表現(xiàn)出側(cè)枝生長(zhǎng)增強(qiáng)，在 ABA信號(hào)和吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）運(yùn)輸途徑中發(fā)揮作用[28]。OsWRKY74參與了磷、鐵和氮營(yíng)養(yǎng)元素的吸收及對(duì)冷脅迫的應(yīng)答[29]。超表達(dá)OsWRKY76的水稻對(duì)Xoo抗性下降[30]。OsWRKY87超表達(dá)使水稻莖稈伸長(zhǎng)[31]。OsWRKY104超表達(dá)的水稻生長(zhǎng)遲緩，株高降低，轉(zhuǎn)錄水平受茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和紫外線B（UV-B）的誘導(dǎo)表達(dá)，并提高了水稻對(duì)稻瘟病的抗性[32]。綜上可見(jiàn)，WRKY家族基因在水稻正常生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)與生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室（molecular biology & bioinformatics lab，MBB）前期鑒定了一個(gè)水稻轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY68，該蛋白質(zhì)在葉片中組成型表達(dá)，在水稻接種白葉枯病菌后誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)量逐漸增加，OsWRKY68蛋白質(zhì)在體外能與下游靶基因OsPR1b和OsPR10a啟動(dòng)子上游的W-box元件結(jié)合[33]。文獻(xiàn)報(bào)道OsWRKY68的轉(zhuǎn)錄水平受赤霉素（gibberellic acid，GA3）和ABA的誘導(dǎo)表達(dá)[34]，在冷、水淹、PEG、H2O2、NaCl和白背飛虱（white backed planthopper，WBPH）處理后轉(zhuǎn)錄下調(diào)[35-36]。轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)雖然能為功能研究提供一些線索，但蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者，因此，了解 OsWRKY68蛋白質(zhì)的表達(dá)特征，對(duì)增進(jìn) OsWRKY68功能的了解具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用基于抗體的蛋白質(zhì)組學(xué)策略[37]，通過(guò)免疫印跡技術(shù)分析了水稻不同發(fā)育時(shí)期、不同部位，以及多種逆境和激素處理?xiàng)l件下 OsWRKY68蛋白質(zhì)的表達(dá)特征，獲得了其功能線索，并進(jìn)一步構(gòu)建OsWRKY68的RNAi載體，轉(zhuǎn)化水稻后獲得 OsWRKY68蛋白質(zhì)表達(dá)豐度下降的轉(zhuǎn)基因植株，分析表明轉(zhuǎn)基因植株的株高降低，結(jié)實(shí)率、分蘗數(shù)及小穗數(shù)下降等。增進(jìn)了對(duì) OsWRKY68蛋白質(zhì)表達(dá)特征的了解，豐富了對(duì) OsWRKY68功能的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 水稻種植和脅迫處理

水稻（Oryza sativaL.）TP309和轉(zhuǎn)基因材料種植在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)稻竹園水稻試驗(yàn)田和溫室內(nèi)（2014—2018年，河北保定）。

苗期培養(yǎng)：水稻種子表面消毒后，在30℃蒸餾水中浸泡3 d露白，土培用土壤與蛭石11混合的蛭石土，水培用紗網(wǎng)將露白的種子播放在上面。播種后于光照培養(yǎng)箱（30℃，60 μmol·m-2s-1，L12 h/D12 h）培養(yǎng)5 d，用于后續(xù)非生物脅迫，各種脅迫處理?xiàng)l件參見(jiàn)文獻(xiàn)[38]。

離體葉片處理：選擇四葉期完全伸展的葉片，將葉片剪為2 cm的小段，放置于3 mmol·L-1MES（2,4-morpholino-ethane sulfonic acid）緩沖液中，pH 5.8，于30℃光照培養(yǎng)箱中，分別進(jìn)行恒暗（24 h黑暗）和恒光（24 h光照）處理；激素處理分別為100 μmol·L-1ABA、100 μmol·L-1MeJA、100 μmol·L-1SA 和 1 mmol·L-1乙烯利（ethephon，ET）。

采集種植在水稻試驗(yàn)田中的TP309不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的組織樣品，包括萌發(fā)期、幼苗期、分蘗期、孕穗期以及開(kāi)花期的根、莖、葉、葉鞘、葉枕、穗子、花藥、穎殼和種子等材料，提取蛋白質(zhì)后進(jìn)行免疫印跡分析。

1.2 質(zhì)粒和菌株

pTCK303和pCAMBIA2300質(zhì)粒由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所江光懷博士提供。pEASY-T1質(zhì)粒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。含有水稻OsWRKY68全長(zhǎng)的 cDNA質(zhì)粒 AK072938（Os04g51560）購(gòu)自日本農(nóng)業(yè)生物資源研究所水稻基因組資源中心（Rice Genome Resource Center，National Institute of Agrobiological Sciences）。

1.3 RNAi載體構(gòu)建和水稻轉(zhuǎn)化

首先以pTCK303質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增獲得水稻Intron序列，正向引物序列為5′-GCAAGCTTGGATCC CCGGGTACCCTCGAG-3′（下劃線為Hind Ш酶切位點(diǎn)），反向引物序列為5′-GCGATATC CTGCAGGAG CTCTCTAGAACTAGTATCG-3（′下劃線為EcoRV酶切位點(diǎn)），將Intron序列連接到pEASY-T1質(zhì)粒構(gòu)建中間載體。然后選取水稻OsWRKY68cDNA的兩段長(zhǎng)約220 bp編碼序列（RNAi1：5′-TGGACCTGATGGGCTGCTA CGCCCCGCGCCGCGCAGACGACCAGCTCGCCAT CCAGGAGGCGGCCACCGCCGGCCTCCGCAGCCT GGAGATGCTCGTGTCGTCCCTCTCCTCCTCCTCT CAGGCCGCCGGGGCTCACAAGGCCTCGCCGCAG CAGCAGCCGTTCGGCGAGATCGCCGACCAGGCC GTCTCCAAGTTCCGCAAGGTCATCTCCATCCTCG ACCG-3′；RNAi2：5′-ACGTCGTTCTTCTCGTCGGTG ACGGCCGGCGAGGGAAGCGTTTCCAAGGGCCGG AGCCTGCTCTCCTCCGGCAAGCCGCCGCTGTCTG GGCACAAGCGGAAGCCCTGCGCCGGCGGCCACT CCGAGGCCACCGCCAACGGCGGCCGCTGCCACT GCTCCAAGAGAAGGAAGAACCGGGTGAAGAGG ACGATCCGAGTGCCGGCAATCAGCTCGAAGAT-3′）作為靶序列，設(shè)計(jì)引物并添加酶切位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，RNAi1的正向引物序列為 5′-CCGGATCCGAGCTCTGGAC CTGATGGGCTGCTAC-3′（下劃線分別為BamHⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)），反向引物序列為 5′-TTGGTACCACTAGTCGGTCGAGGATGGAGATGA C-3′（下劃線分別為SpeⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)）；RNAi2的正向引物序列為 5′-GGGGATCCGAGCTCACGTC GTTCTTC TCGTCGGT-3′（下劃線分別為BamHⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)），反向引物序列為5′-TTGGTACCACTAGTATCTTCGAGCTGATTGC CGG-3（′下劃線分別為SpeⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)）。將獲得的 RNAi片段正向和反向插入帶有 Intron序列的中間載體形成pEASY-T1- RNAi質(zhì)粒。最后把測(cè)序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)Hind III和PstⅠ雙酶切插入到 pCAMBIA2300質(zhì)粒，構(gòu)建OsWRKY68RNAi表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻TP309，遺傳轉(zhuǎn)化由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

OsWRKY68RNAi轉(zhuǎn)基因植株驗(yàn)證的上游引物為35S啟動(dòng)子的部分序列（5′-GAGTCGTAAGAGACTC TGTATG-3′），下游引物為水稻 Intron的部分序列（5′-CTTTATCTACTGCCGTGGAAC-3′）。擴(kuò)增條件為 94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增片段大小約為1 000 bp，1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。引物由北京華大基因研究中心有限公司合成。

1.5 水稻蛋白質(zhì)的提取及免疫印跡（Western blot，WB）檢測(cè)

采集水稻組織樣品，液氮速凍后，-70℃保存?zhèn)溆谩龃娴乃緲悠吩谝旱谐浞盅心?，?00 mg樣品加入1 mL蛋白質(zhì)提取液（62.5 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.4、10%甘油、0.1% SDS、2 mmol·L-1EDTA、1 mmol·L-1PMSF和5% DTT），混勻冰上放置10 min，12 000 r/min，4℃離心20 min，取上清即為總蛋白質(zhì)。WB試驗(yàn)至少重復(fù)3次，使用OsHSP82蛋白質(zhì)作為等量加樣的內(nèi)參進(jìn)行檢測(cè)[39]。在膜上滴加皮克級(jí) ECL發(fā)光液（百智生物）并使用 Sage Capture軟件掃描WB條帶信號(hào)[40]。使用 OsWRKY68特異的多克隆抗體進(jìn)行表達(dá)特征分析和轉(zhuǎn)基因材料的WB鑒定[33]。通過(guò) Lane 1D軟件的凝膠分析系統(tǒng)采集 WB檢測(cè)中OsWRKY68和OsHSP82蛋白質(zhì)的信號(hào)，計(jì)算獲得相同OsHSP82情況下，OsWRKY68蛋白質(zhì)的含量，然后進(jìn)行定量比較。OsWRKY68多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、OsHSP82單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購(gòu)自北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司。

1.6 水稻農(nóng)藝性狀調(diào)查和轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定

將TP309和OsWRKY68RNAi轉(zhuǎn)基因材料種植于水稻試驗(yàn)田，成熟后隨機(jī)選取10株調(diào)查株高（主莖第一個(gè)伸長(zhǎng)節(jié)基部到第一個(gè)小穗著生位置的距離）、分蘗數(shù)（主莖及分蘗莖的總數(shù)，包括有效分蘗和無(wú)效分蘗）、穗長(zhǎng)（第一個(gè)小穗著生位置起至穗子頂部）、小穗數(shù)和結(jié)實(shí)率。計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差并進(jìn)行差異顯著性分析，繪制柱形圖。

2 結(jié)果

2.1 OsWRKY68蛋白質(zhì)在水稻正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特征

為了解 OsWRKY68蛋白質(zhì)在水稻正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特征，采集水稻TP309不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的多個(gè)組織樣品，包括萌發(fā)期的種子（浸種 1、2和3 d）；幼苗（長(zhǎng)度分別為1、2、3和5 cm）；分蘗期的葉片上、中、下部；孕穗期的幼穗（長(zhǎng)度分別為0.5、1、2、4、6.5、8、10.5、12、14和23.5 cm）、葉片上、中、下部；開(kāi)花期的莖間和莖節(jié)（由下到上分為1—5節(jié)），以及不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的根尖、葉枕和葉鞘，提取總蛋白質(zhì)后用 OsWRKY68特異抗體進(jìn)行WB檢測(cè)（圖1）。由圖1可見(jiàn)，OsWRKY68在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的組織中基本呈組成型表達(dá)，分子量約為32 kD，和預(yù)測(cè)大小相符，且在大部分組織中其表達(dá)豐度差異倍數(shù)不大，只是在個(gè)別組織中（如孕穗期的幼穗），隨著幼穗長(zhǎng)度的增加其表達(dá)豐度逐漸降低。在分蘗期和孕穗期的葉鞘中不表達(dá)，僅在開(kāi)花期的葉鞘中表達(dá)。在開(kāi)花期，花藥中的 OsWRKY68表達(dá)豐度高于成熟穗、穗軸和穎殼。從蛋白質(zhì)的組成型表達(dá)特征來(lái)看，OsWRKY68應(yīng)該在水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中多個(gè)時(shí)期和組織中發(fā)揮作用。

圖1 OsWRKY68蛋白質(zhì)在水稻不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)特征Fig. 1 Expression profiling of OsWRKY68 protein in different tissues at different developmental stages

2.2 OsWRKY68蛋白質(zhì)在非生物脅迫下的表達(dá)特征

利用前期建立的 RiceS-A300水稻組織樣品資源庫(kù)和離體葉片脅迫處理樣品，用WB檢測(cè)OsWRKY68蛋白質(zhì)的表達(dá)特征。由圖2-A可見(jiàn)，正常生長(zhǎng)的對(duì)照植株表達(dá)豐度維持不變， NaCl（200 mmol·L-1）脅迫處理時(shí)，OsWRKY68蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)下降，在2 d時(shí)已經(jīng)下降了一半以上，3 d時(shí)基本檢測(cè)不到。由圖 2-B可見(jiàn)，離體葉片在恒光處理后OsWRKY68表達(dá)量持續(xù)上升，3 d時(shí)出現(xiàn)一條分子質(zhì)量較大的條帶，且表達(dá)量逐漸增加，為了區(qū)分所出現(xiàn)的分子質(zhì)量較大的條帶，將其標(biāo)注為 OsWRKY68+，OsWRKY68+的分子量略小于45 kD，與OsWRKY68相差 10 kD左右，從分子量大小的變化推測(cè)是OsWRKY68翻譯后修飾或不同的選擇性拼接的蛋白質(zhì)形式。這一結(jié)果提示 OsWRKY68蛋白質(zhì)在鹽和恒光脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮作用。除上述非生物逆境下的表達(dá)特征發(fā)生變化外，在受檢的其他脅迫處理?xiàng)l件下，未見(jiàn)明顯的表達(dá)特征改變（結(jié)果未附）。

圖2 水稻OsWRKY68蛋白質(zhì)在非生物脅迫下的表達(dá)特征Fig. 2 Expression profiling of OsWRKY68 protein under abiotic stresses

2.3 OsWRKY68蛋白質(zhì)在激素處理?xiàng)l件下的表達(dá)特征

為了解OsWRKY68蛋白質(zhì)表達(dá)與激素處理的相關(guān)性，選擇四葉期完全伸展的葉片，剪下葉片進(jìn)行離體激素處理（圖3）。WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照葉片的OsWRKY68表達(dá)豐度基本維持不變，而MeJA（100 μmol·L-1）及乙烯利（1 mmol·L-1）處理5 d時(shí)均能誘導(dǎo)OsWRKY68+的表達(dá)豐度升高，但ABA和SA處理（結(jié)果未附）沒(méi)有明顯影響OsWRKY68的表達(dá)。這一結(jié)果提示OsWRKY68蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮可能與激素MeJA和乙烯相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)聯(lián)。

2.4 OsWRKY68 RNAi載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定

首先以含有OsWRKY68全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒為模板，將選定的 RNAi片段擴(kuò)增出來(lái)，如圖4-A所示，PCR片段大小約為250 bp，再將RNAi片段正向和反向插入帶有Intron序列的中間載體，成為pEASY-T1-RNAi質(zhì)粒，經(jīng)Hind Ⅲ和SacⅠ雙酶切后電泳檢測(cè)大小正確（圖4-B），測(cè)序驗(yàn)證后，將正向和反向的RNAi片段插入到轉(zhuǎn)化終載體pCAMBIA-2300中，Hind Ⅲ和PstⅠ雙酶切驗(yàn)證，確認(rèn)與理論值大小相符（圖4-C），證明獲得了正確的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsWRKY68的RNAi質(zhì)粒導(dǎo)入水稻受體TP309，T0代獲得了24個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（line）。對(duì)這24個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR鑒定，得到6個(gè)陽(yáng)性lines，將PCR陽(yáng)性的lines種植并在后代中繼續(xù)通過(guò)PCR和WB進(jìn)行鑒定，在T3代獲得4個(gè)PCR和WB陽(yáng)性的OsWRKY68 RNAi的轉(zhuǎn)基因株系Y316、Y317、Y326和Y337。WB結(jié)果表明，在4個(gè)轉(zhuǎn)基因材料中，OsWRKY68蛋白質(zhì)的表達(dá)量比野生型TP309分別下降了31%、35%、70%和48%（圖5）。

2.5 OsWRKY68蛋白質(zhì)敲低轉(zhuǎn)基因水稻的農(nóng)藝性狀鑒定

對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行了表型和農(nóng)藝性狀調(diào)查（圖6）。結(jié)果表明，與野生型相比，OsWRKY68蛋白質(zhì)敲低的轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)為株高、分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)和結(jié)實(shí)率等指標(biāo)的顯著降低，而生育期沒(méi)有明顯的差別。說(shuō)明降低OsWRKY68的表達(dá)對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了比較嚴(yán)重的影響，由此說(shuō)明正常表達(dá)的OsWRKY68蛋白質(zhì)對(duì)維持水稻的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。

3 討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，已有多篇報(bào)道證明水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子在生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)外界逆境脅迫時(shí)都發(fā)揮重要的作用。

圖3 水稻OsWRKY68蛋白質(zhì)受MeJA和乙烯利誘導(dǎo)表達(dá)Fig. 3 The expression of OsWRKY68 protein were induced by MeJA and ET treatments

圖4 水稻OsWRKY68 RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證Fig. 4 The construction and verification of transformation plasmid for OsWRKY68 RNAi

圖5 OsWRKY68 RNAi轉(zhuǎn)基因株系的鑒定Fig. 5 The identification of OsWRKY68 RNAi transgenic lines

圖6 水稻OsWRKY68 RNAi轉(zhuǎn)基因株系的表型和農(nóng)藝性狀鑒定Fig. 6 The phenotype and agronomic traits of OsWRKY68 RNAi transgenic lines

MBB前期鑒定到 OsWRKY68在水稻-白葉枯病菌互作中表達(dá)上調(diào)，本研究試圖進(jìn)一步挖掘OsWRKY68的功能。用免疫印記技術(shù)檢測(cè)了 OsWRKY68蛋白質(zhì)在水稻不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和不同組織部位、非生物脅迫和激素誘導(dǎo)下的表達(dá)特征，結(jié)果表明，OsWRKY68在水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中基本呈組成型表達(dá)，OsWRKY68在鹽脅迫過(guò)程中表達(dá)量降低，OsWRKY68表達(dá)受光照、MeJA和乙烯利的誘導(dǎo)。經(jīng)轉(zhuǎn)基因獲得了OsWRKY68下調(diào)的水稻材料，表現(xiàn)出株高、分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)和結(jié)實(shí)率等重要農(nóng)藝性狀的顯著降低，說(shuō)明該基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮作用，表達(dá)特征數(shù)據(jù)也提示其在鹽脅迫、光照、乙烯利和MeJA等激素處理過(guò)程中發(fā)揮作用。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者，對(duì)蛋白質(zhì)的豐度、修飾等變化的研究對(duì)了解其功能具有重要的指導(dǎo)意義。本研究發(fā)現(xiàn) OsWRKY68蛋白質(zhì)在種子萌發(fā)期、幼苗期、分蘗期、孕穗期以及開(kāi)花期的根、莖、葉、穗子和種子等絕大部分組織中均有表達(dá)，一般組織中其豐度波動(dòng)幅度不大，但在花藥中表達(dá)豐度較高（圖1）。將蛋白質(zhì)表達(dá)特征與基于 RNA-seq轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）進(jìn)行比對(duì)，在水稻雌蕊和花藥中OsWRKY68的轉(zhuǎn)錄水平較高，在多種組織中都能檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄信號(hào)，說(shuō)明蛋白質(zhì)表達(dá)和轉(zhuǎn)錄二者間具有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。OsWRKY68RNAi轉(zhuǎn)基因水稻的結(jié)實(shí)率降低，提示表達(dá)豐度可能與花藥的發(fā)育以及結(jié)實(shí)率有關(guān)。對(duì)水稻OsWRKY68上游啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，其含有器官特異性表達(dá)的 POLLEN元件（https：//omictools.com/plantcare-tool），且在開(kāi)花期的葉枕和葉鞘中其表達(dá)量均比分蘗期和孕穗期高（圖1）。另有文獻(xiàn)報(bào)道OsWRKY68在耐旱型水稻近等基因系材料中呈現(xiàn)花序特異性表達(dá)[34]，提示OsWRKY68在開(kāi)花期發(fā)揮重要作用。

非生物逆境如干旱、淹澇、高鹽、低溫和高溫等都是降低水稻產(chǎn)量的影響因素。轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境信號(hào)傳遞和調(diào)控功能基因表達(dá)過(guò)程中起著核心調(diào)節(jié)作用，鹽脅迫是影響鹽／堿稻區(qū)水稻產(chǎn)量的主要逆境因素，在水稻中已鑒定出幾個(gè)參與耐鹽的基因[41]。超表達(dá)OsWRKY13抑制水稻對(duì)鹽的應(yīng)答[6]。OsWRKY45-2是鹽脅迫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控因子[42]。在擬南芥中超表達(dá)WRKY42提高了耐鹽能力[15]。水稻OsWRKY68在鹽處理后轉(zhuǎn)錄下調(diào)[35]。擬南芥的AtWRKY18和AtWRKY60單突和雙突植株對(duì)鹽脅迫的耐受性均比野生型高[43]。本研究結(jié)果表明 OsWRKY68蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度受到鹽和光照等因素的調(diào)控，提示其可能參與這些脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，OsWRKY68敲低轉(zhuǎn)基因材料的獲得，為鑒定其在鹽脅迫和光照處理過(guò)程中的功能奠定了基礎(chǔ)。水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）等信號(hào)分子能夠激活植物體內(nèi)防御基因的表達(dá)，從而使植物表現(xiàn)出對(duì)生物脅迫的抗性反應(yīng)。OsWRKY13轉(zhuǎn)錄因子可激活SA依賴的信號(hào)途徑并抑制 JA依賴的信號(hào)途徑，直接或間接調(diào)控SA和JA上下游基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)水稻的抗病性[8]。OsWRKY114和OsWRKY117受MeJA的誘導(dǎo)表達(dá)[36]。本研究發(fā)現(xiàn) OsWRKY68蛋白質(zhì)受 ET和MeJA的誘導(dǎo)表達(dá)，MBB前期研究發(fā)現(xiàn) OsWRKY68在水稻接種Xoo后表達(dá)量增加[33]，由此可推測(cè)OsWRKY68在耐鹽和抗白葉枯病過(guò)程中的功能發(fā)揮與乙烯/茉莉酸途徑有關(guān)。

本研究對(duì) OsWRKY68蛋白質(zhì)表達(dá)特征的調(diào)查涉及的樣品超過(guò)500個(gè)，蛋白質(zhì)的存在部位、豐度變化及受誘導(dǎo)的情況為了解蛋白質(zhì)的功能提供了重要的線索，也可以認(rèn)為，表達(dá)特征是功能的一種表現(xiàn)形式。除了鑒定到蛋白質(zhì)豐度的變化外，還鑒定到更高分子量條帶（OsWRKY68+）的出現(xiàn)，這種現(xiàn)象以前也報(bào)道過(guò)[33]，水稻體內(nèi)的OsWRKY68分子量為32 kD，WB檢測(cè)到的OsWRKY68+的分子質(zhì)量大于32 kD，略小于45 kD。從分子量大小推測(cè)，OsWRKY68+可能是 OsWRKY68翻譯后修飾，或者是不同選擇性拼接形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)槎寄鼙煌豢贵w特異識(shí)別，所以一定帶有相同的識(shí)別區(qū)域。在恒光、MeJA和乙烯利處理后，WB檢測(cè)到的 OsWRKY68+的表達(dá)量增加，說(shuō)明在這些處理過(guò)程中，提高了OsWRKY68+的豐度，或者說(shuō)，OsWRKY68+的蛋白質(zhì)形式可以被這些處理特異誘發(fā)。能夠直觀地看到不同的蛋白質(zhì)形式，是 WB的一個(gè)特點(diǎn)。對(duì)特定蛋白質(zhì)形式的了解有助于功能的挖掘和闡釋。對(duì)這些變化信息的深度挖掘?qū)⒂兄诹私獠煌鞍踪|(zhì)形式（Form）的功能，希望將來(lái)能對(duì)此現(xiàn)象有更具體的解釋。

水稻中有近百個(gè) WRKY基因，同一個(gè)代謝過(guò)程中會(huì)有多個(gè)WRKY共同參與[18]，有些WRKY成員除了調(diào)控下游靶基因之外，WRKY基因之間甚至自身也可以相互調(diào)節(jié)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些 WRKY基因的啟動(dòng)子上游也存在W-box或類W-box序列，如OsWRKY13[6]、OsWRKY45[42]和OsWRKY68[33]等。MBB 前期研究結(jié)果表明OsWRKY68可以與OsPR1b和OsPR10a的W-box結(jié)合[33]，提示對(duì)W-box元件的篩選有助于下游靶基因的鑒定。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的功能蛋白質(zhì)，每一個(gè)不同的WRKY成員都有其特定的功能，李莉云等[44]比較系統(tǒng)地對(duì) WRKY家族成員的功能和轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行了整理。本研究通過(guò)系統(tǒng)調(diào)查水稻 OsWRKY68蛋白質(zhì)在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期不同組織部位，以及多種非生物脅迫和激素處理?xiàng)l件下的表達(dá)特征，鑒定到OsWRKY68在鹽脅迫、光照和激素（MeJA和ET）處理?xiàng)l件下表達(dá)豐度發(fā)生了變化，為進(jìn)一步深入探討其功能提供了線索，OsWRKY68RNAi轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)蛋白質(zhì)豐度的下調(diào)，同時(shí)顯著降低了水稻的株高和分蘗數(shù)等，表明該基因在水稻正常生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中都扮演重要角色。

4 結(jié)論

水稻轉(zhuǎn)錄因子 OsWRKY68參與水稻正常生長(zhǎng)發(fā)育，鹽脅迫時(shí)表達(dá)量下降，受光照、MeJA和ET的誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明該蛋白質(zhì)具有廣譜的功能，OsWRKY68RNAi轉(zhuǎn)基因材料的株高、結(jié)實(shí)率、分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)和小穗數(shù)顯著降低。