李林 魏振宇 尉秀清

【摘要】目的構(gòu)建能夠分泌尿鳥苷素的嬰兒雙歧桿菌，觀察其對結(jié)腸上皮細(xì)胞環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）合成的影響，為用尿鳥苷素基因重組雙歧桿菌治療便秘做前期準(zhǔn)備。方法以質(zhì)粒pBV220為模板，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pBV220-ESS-uroguanylino重組質(zhì)粒pBV 220-ESS-uroguanylin電擊轉(zhuǎn)化嬰兒雙歧桿菌。用ELISA檢測重組嬰兒雙歧桿菌中尿鳥苷素的表達(dá)情況及其上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞T84內(nèi)cGMP合成的能力。結(jié)果pBV 220-ESS-uroguanylin陽性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行基因測序，證實(shí)載體構(gòu)建成功，測序正確無突變。ELISA檢測證實(shí)重組嬰兒雙歧桿菌成功表達(dá)尿鳥苷素，具有上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞T84內(nèi)cGMP合成的能力。結(jié)論重組雙歧桿菌構(gòu)建成功并能分泌尿鳥苷素，提高結(jié)腸上皮細(xì)胞cGMP的合成。

【關(guān)鍵詞】尿鳥苷素;雙歧桿菌;環(huán)磷酸鳥苷

尿鳥苷素是小腸黏膜細(xì)胞分泌的一種具有調(diào)節(jié)腸道水鈉代謝作用的16膚[1]。尿鳥苷素作用于小腸黏膜上皮細(xì)胞鳥苷酸環(huán)化酶2C受體，使細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量升高，進(jìn)而激活蛋白激酶A，使囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CFTR）磷酸化，增強(qiáng)氯離子和碳酸氫根離子的跨膜轉(zhuǎn)移，使腸腔內(nèi)氯離子和碳酸氫根離子分泌增加，從而導(dǎo)致水鈉分泌增加、腸道蠕動能力增強(qiáng)，此生理作用可顯著改善慢性便秘及便秘型腸易激綜合征[2]。

隨著益生菌潛在健康益處被挖掘和基因工程技術(shù)的進(jìn)步，選擇益生菌作為載體系統(tǒng)，表達(dá)特定功能的蛋白質(zhì)，探索其在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用潛力越來越受重視。雙歧桿菌是人類腸道重要的菌群。越來越多的研究對重組雙歧桿菌在疾病治療、疫苗制作以及對人類有益的功能性蛋白的分泌領(lǐng)域進(jìn)行初步探索[3]。嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697已應(yīng)用于乳制品和食品領(lǐng)域，是一種安全的食用菌。我們將尿鳥苷素基因重組到質(zhì)粒pBV220中，使其在宿主菌嬰兒雙歧桿菌中表達(dá)，然后進(jìn)一步驗(yàn)證其是否能夠增加結(jié)腸癌細(xì)胞T84內(nèi)cGMP的合成，從而為該重組嬰兒雙歧桿菌具有通過cGMP-蛋白激酶A-CFTR調(diào)節(jié)軸而影響水鈉代謝的能力提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為后期研究其是否能作為一種治療便秘的生物制劑做前期準(zhǔn)備。

材料與方法

一、細(xì)胞、菌種與質(zhì)粒

嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697購自廣東省微生物菌種保藏中心，pBV220質(zhì)粒購自武漢森靈生物科技有限公司，結(jié)腸癌T84細(xì)胞由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存，含有pBV220質(zhì)粒的嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697（前期已構(gòu)建，由暨南大學(xué)第二理工樓734姚冬生教授實(shí)驗(yàn)室保存）。

二、主要試劑和儀器

1.主要試劑

限制性內(nèi)切酶（Neb，美國），尿鳥苷素ELISA試劑盒（Cusabio，武漢），cGMP ELISA試劑盒（Elabscience，武漢），TPY液體/固體培養(yǎng)基（海博生物公司，青島），ActilightP（日本Meiji公司，由上海格信企業(yè)贈送），質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）。

2.主要儀器

多功能酶標(biāo)儀（美谷分子儀器，上海），ECM399電轉(zhuǎn)儀（BTX，美國），DYY-10型電泳儀（六一儀器廠，北京），Mini離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.pBV220改造

從NCBI獲得相關(guān)基因序列信息后，按圖1設(shè)計(jì)交由上海捷瑞生物工程有限公司全基因合成并組裝載體，獲得由質(zhì)粒pBV220改造后得到的質(zhì)粒pBV220-ESS-uroguanylino pBV220質(zhì)粒由我國預(yù)防醫(yī)學(xué)院病毒研究所自行構(gòu)建，屬于溫度誘導(dǎo)表達(dá)型，誘導(dǎo)溫度為42℃[4]。

2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化嬰兒雙歧桿菌

將嬰兒雙歧桿菌用TPY培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48 h，按1：10接種于TPI培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)12h，再按1：20接種到120ml含有16% Actilight.P的TPY培養(yǎng)基培養(yǎng)中，12～16h后吸光度（OD）。

ESS序列包含了amy B基因（青春雙歧桿菌INT57的淀粉酶基因）中的啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及信號肽區(qū)域（參考序列GenBank編號：AY240946.1）：Uroguanylin為尿鳥苷素成熟肽序列（序列前加ATG，末尾加TAA，參考序列NCBI編號為NM 007102.3）;上述目的基因序列通過EcoR I和Pst I雙酶切連接到質(zhì)粒pBV220的多克隆位點(diǎn)上;所有工作委托上海捷瑞生物工程有限公司完成值達(dá)到0.2～0.3，8000轉(zhuǎn)/分4℃離心10min，去除上清后用pH為7的5mmol幾磷酸鉀緩沖液洗3次，用1ml KMR緩沖液（5mmol/L磷酸二氫鉀，1mmol/L氯化鎂，0.3 mol幾棉子糖）重懸細(xì)胞，0℃過夜。取100μl細(xì)胞懸液與0.25μg重組質(zhì)粒pBV220-ESS-uroguany&n混合，轉(zhuǎn)移至電擊杯，冰浴5min，12.5 kV/cm電擊，立即用5ml含有16%Actilight■P的TPI培養(yǎng)基復(fù)蘇細(xì)菌，37℃厭氧培養(yǎng)16h（電轉(zhuǎn)化方法參考Rossi等[5]研究）。將菌液涂布到含有100μg/ml氨芐青霉素的TPY固體平板，37℃厭氧培養(yǎng)48h，同時(shí)接種另一組未轉(zhuǎn)染抗性質(zhì)粒的嬰兒雙歧桿菌至同樣含氨芐青霉素的平板上作為陰性對照。48h后挑取陽性克隆接種至10ml TPY液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)48h，離心去除上清，用50mg/ml的溶菌酶37℃處理菌體2h，離心取上清，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒用EcoR I和Pst I雙酶切鑒定，質(zhì)粒pBV220作為陰性對照。

3.尿鳥苷素ELISA試劑盒檢測尿鳥苷素基因在雙歧桿菌的表達(dá)

將空白對照組（野生型嬰兒雙歧桿菌ATCC15697）、空載對照組（含有pBV220質(zhì)粒的嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697雙歧桿菌，前期已構(gòu)建）、重組質(zhì)粒組（含重組質(zhì)粒pBV 220-ESS-uroguanylin的嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697）用TPY培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)36h，然后再42℃厭氧培養(yǎng)16h，離心取上清液作為檢測樣本。按尿鳥苷素ELISA試劑盒說明書要求進(jìn)行檢測，簡要步驟如下：室溫下平衡各種試劑1h;分別加標(biāo)準(zhǔn)品、各組細(xì)菌培養(yǎng)的上清液100μl/孔，37℃孵育2h;去除孔內(nèi)液體;每孔加生物素標(biāo)記抗體100μl，37℃孵育1h;洗板3次：每孔加HRP-avidin100μl，37℃孵育-h;洗板5次;每孔加TMB底物90μl，37℃避光孵育20～30min：每孔加入終止液50μl。用多功能酶標(biāo)儀檢測反應(yīng)物的OD₄₅₀。

4.cGMP ELISA試劑盒檢測工程菌分泌的尿鳥苷素的生物活性

將含重組質(zhì)粒pBV 220-ESS-uroguanylin的雙歧桿菌（重組質(zhì)粒組）37℃培養(yǎng)36h，然后再42℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，同樣方法培養(yǎng)野生型雙歧桿菌（空白對照組）和含有pBV220質(zhì)粒的雙歧桿菌（空載對照組）。在4個(gè)6孔板用含有10%胎牛血清的DMEM洗2次培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞T84，48h后吸去每孔的培養(yǎng)基，然后每孔加入1ml含10%胎牛血清的DMEM洗2次;每孔再加入1ml含10%胎牛血清和1mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的DMEM、37℃孵育1h;然后將各組細(xì)菌培養(yǎng)上清液加入到孔板中（每組菌液上清分別加8個(gè)孔，每孔1ml），孵育1h。去除培養(yǎng)液，每孔加入一ml lmol/LHCl 20℃孵育30min，裂解細(xì)胞獲得cGMP（該方法參考Cuppoletti等[6]提取腫瘤細(xì)胞cGMP的步驟）;離心取上清液用cGMP ELISA試劑盒檢測工程菌分泌的尿鳥苷素的生物活性，簡要步驟如下：每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各50μl，立即加入50μl生物素化抗體工作液，37℃孵育45min;洗滌3次;加人100μl酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30min;洗滌5次;加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右;加入50μl終止液，立即用多功能酶標(biāo)儀檢測反應(yīng)物的OD₄₅₀。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)量資料以x1s表示，方差不齊，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩兩比較用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)，α=0.05。

結(jié)果

一、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化嬰兒雙歧桿菌

重組質(zhì)粒pBV 220-ESS-uroguanylin電轉(zhuǎn)化后的雙歧桿菌在含有100μg/ml氨節(jié)青霉素的平板長滿了單克隆菌落，而野生型雙歧桿菌（空白對照組）在含有100μ/gml氨芐青霉素的平板沒有菌落生長，重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化雙歧桿菌，見圖2。為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒已經(jīng)轉(zhuǎn)人雙歧桿菌，用試劑盒提取陽性克隆的質(zhì)粒后與陰性對照質(zhì)粒pBV220同時(shí)做雙酶切驗(yàn)證，見圖3。雙酶切驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒pBV220-ESS-uroguanylin成功轉(zhuǎn)化嬰兒雙歧桿菌。

1為DNA Marker DL10004：2為對照組質(zhì)粒pBV220、雙酶切獲得3666bp大小的片段;3為陽性克隆的質(zhì)粒，雙酶切獲得3666bp和714bp 2個(gè)片段

二、各組別尿鳥苷素表達(dá)情況

各組細(xì)菌尿鳥苷素表達(dá)情況ELISA檢測結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒組反應(yīng)終產(chǎn)物OD₄₅₀（0.29±0.03）分別與空白對照組反應(yīng)終產(chǎn)物OD₄₅₀（0.06 1 0.01）和空載對照組反應(yīng)終產(chǎn)物OD₄₅₀（0.07±0.02）比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z分別為-3.733和-3.016、P均<0.05/3）;而空白對照組OD₄₅₀和空載對照組OD4so比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.672，P=0.501）。

已知野生型嬰兒雙歧桿菌不會分泌尿鳥苷素，因此可以證明含重組質(zhì)粒pBV 220-ESS-uroguanylin的雙歧桿菌成功分泌尿鳥苷素。含重組質(zhì)粒pBV220-ESS-uroguanylin的雙歧桿菌尿鳥苷素表達(dá)量的計(jì)算方法為：重組質(zhì)粒組OD4so一空載對照組OD。。，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及擬合方程（由標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果通過軟件OriginPro 8.0用4參數(shù)Logistic擬合進(jìn)行回歸分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線及擬合曲線，見圖4）計(jì)算出重組嬰兒雙歧桿菌尿鳥苷素表達(dá)量約為652.23 pg/ml（約0.38 nmol/L）。

三、各組別尿鳥苷素的生物活性檢測情況

尿鳥苷素的生物活性是通過其上調(diào)cGMP的作用達(dá)到的，采用cGMP ELISA試劑盒檢測。因該試劑盒采用的是競爭抑制ELISA，因此反應(yīng)終產(chǎn)物的OD₄₅₀和cGMP濃度成反比。

各組細(xì)菌ELISA檢測結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒組反應(yīng)終產(chǎn)物OD4so（0.05±0.00）分別與空白對照組

通過標(biāo)準(zhǔn)品獲得相應(yīng)濃度（作為因變量）下的OD值（作為自變量），通過軟件OriginPro 8.0用四參數(shù)Logistic擬合進(jìn)行回歸分析，獲得尿鳥苷素ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為y=d-（a+d）/[1+（x/c）b]（a=0.007，b=0.932，c=3.525，d=5840.3），r²=0.999，檢測范圍31.25一2000pg/m反應(yīng)終產(chǎn)物OD₄₅₀（0.43±0.02）和空載對照組反應(yīng)終產(chǎn)物OD₄₅₀（0.41±0.03）比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z分別為3.683和3.116，P均<0.05/3）;而空白對照組OD₄₅₀和空載對照組OD、、比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.567，P=0.571）。

競爭抑制ELISA的反應(yīng)終產(chǎn)物的OD₄₅₀和cGMP濃度成反比，即重組質(zhì)粒組的cGMP含量較對照組升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合上一步尿鳥苷素表達(dá)檢測結(jié)果，可以證明重組嬰兒雙歧桿菌分泌表達(dá)的尿鳥苷素導(dǎo)致了cGMP的升高，具有和人體天然分泌的尿鳥苷素相同的生理活性。

討論

便秘是一種常見的以排便功能障礙為特征的疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，世界各地便秘的平均患病率為16%左右，而60歲以上患病率升高至30%以上[7。女性患病率是男性的4倍以上[8]。便秘的高患病率和便秘治療藥物的高使用頻率給患者的生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重影響，同時(shí)造成了巨大的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療資源的占用。尋找安全、方便、有效、物美價(jià)廉的便秘治療藥物是重要研究課題。

自從聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和WHO將益生菌定義為“數(shù)量控制在適當(dāng)范圍內(nèi)對宿主健康有益的微生物”以來，益生菌的商業(yè)應(yīng)用和研究越來越多[9]。而隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)步，通過基因編輯技術(shù)獲得具有促進(jìn)人類健康或治療疾病的能力的功能性益生菌將成為未來的一種趨勢[10]。

我們課題組利用基因工程技術(shù)，將尿鳥苷素基因表達(dá)于益生菌中，從而獲得具有調(diào)節(jié)腸道水鈉分泌功能的益生菌，并進(jìn)一步探究基因工程益生菌在便秘防治中的可行性，以期獲得一種具有治療便秘功能的益生菌，為慢性便秘防治提供一種多元化的經(jīng)濟(jì)有效的策略。

本文所介紹的用質(zhì)粒pBV220將尿鳥苷素基因表達(dá)于嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697為本研究的前期預(yù)實(shí)驗(yàn)部分。本課題組已成功構(gòu)建了一種能穩(wěn)定分泌表達(dá)尿鳥苷素的嬰兒雙歧桿菌ATCC巧697;且該重組菌分泌的尿鳥苷素和人類腸道天然分泌的尿鳥苷素一樣，可上調(diào)腸上皮細(xì)胞cGMP的含量。而研究已經(jīng)表明尿鳥苷素可通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)第二信使cGMP的含量，進(jìn)而通過蛋白激酶A-CFTR調(diào)節(jié)軸，最終使氯離子和碳酸氫根離子的跨膜轉(zhuǎn)移增加，導(dǎo)致腸道水鈉分泌增加、腸道蠕動能力增強(qiáng)。因此可認(rèn)為重組嬰兒雙歧桿菌具有促進(jìn)腸道排泄功能的潛力。

后期實(shí)驗(yàn)中，可通過基因編輯技術(shù)將重組質(zhì)粒pBV 220-ESS-uroguanylin中溫控基因cItS857刪除，從而獲得能夠在人體正常體溫下表達(dá)尿鳥苷素的重組菌，然后讓其在人體腸道定植。因?yàn)橹亟M菌分泌的尿鳥苷素為納米級，作用相對溫和，如果讓其定植在人類腸道，可能可以作為一種定植菌而達(dá)到長期促進(jìn)腸道糞便排泄的效果，需后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。

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（收稿日期：2019-01-18）

（本文編輯：楊江瑜）

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2019.05.005

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81470848）

作者單位：510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科