鄧威威 梁盼盼 蘇真 龔子鑒 陳劍

【摘要】目的 篩選角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染的差異表達(dá)基因與關(guān)鍵基因。方法 構(gòu)建紅色毛癬菌感染人工表皮模型與陰性對(duì)照組一起進(jìn)行RNA-seq測(cè)序分析。結(jié)果 在紅色毛癬菌孢子感染人工表皮后共篩選出了1 564個(gè)差異表達(dá)基因，包括1 102個(gè)上調(diào)基因與462個(gè)下調(diào)基因。這些差異基因的Go分析結(jié)果主要富集于生物學(xué)調(diào)控、膜及膜組分和催化功能。通過(guò)kegg通路分析，差異表達(dá)基因主要富集于與結(jié)直腸癌、賴(lài)氨酸降解和肌醇磷酸代謝相關(guān)通路。另外，蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)PHLPP2和TOP2B這2個(gè)基因節(jié)點(diǎn)的度最高，可能在人角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染中具有重要的作用。結(jié)論 篩選出了1 564個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染的差異表達(dá)基因，這些基因可能在人角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染中具有重要作用。

【關(guān)鍵詞】人工表皮;紅色毛癬菌;核糖核酸-seq

【Abstract】Objective To screen the differentially-expressed and key genes in the keratinocytes in response to Trichophyton rubrum infection.? Methods The artificial epidermis model infected by Trichophyton rubrum was established. RNA-seq was performed in the reconstructed human epidermis and negative controls.? Results A total of 1 564 differentially-expressed genes were identified， including 1 102 up-regulated genes and 462 down-regulated genes after the artifical epidermis was infected by Trichophyton rubrum. The gene ontology （GO） analysis indicated that the majority of the target genes were related to biological regulation， membrane， membrane component and catalytic function. Kegg pathway analysis revealed that most target genes were distributed in the colorectal cancer， lysine degradation and inositol phosphate metabolism signaling pathways. In addition， protein-protein interaction networks demonstrated that PHLPP2 and TOP2B had the highest degree of connected node， which might play a critical role in keratinocytes challenged with Trichophyton rubrum.? Conclusions A total of 1 564 differentially-expressed genes are screened in the keratinocytes in response to Trichophyton rubrum infection， which probably play a pivotal role in keratinocytes against Trichophyton rubrum infection.

【Key words】Reconstructed human epidermis;Trichophyton rubrum;RNA-seq

皮膚癬菌感染導(dǎo)致的淺部真菌病是人類(lèi)最常見(jiàn)的疾病之一，發(fā)病率非常高，累及約20% ～ 25%的世界人口[1-3]。不僅嚴(yán)重地影響了患者的身心健康而且導(dǎo)致了巨額的醫(yī)療支出[4-6]。其中紅色毛癬菌是最主要的致病菌[7-8]。其感染多呈慢性且極易復(fù)發(fā)。如何徹底清除紅色毛癬菌，避免復(fù)發(fā)一直是治療上的一個(gè)難題。由于紅色毛癬菌感染主要局限于表皮角質(zhì)層，角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)紅色毛癬菌的識(shí)別是激發(fā)皮膚炎癥和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵，在機(jī)體徹底清除紅色毛癬菌的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究構(gòu)建了新型的紅色毛癬菌感染人工表皮模型。并以此模型開(kāi)展人角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染的差異表達(dá)基因的研究。

材料與方法

一、人工表皮

人工表皮EpkSkin購(gòu)自上海斯安諾生物科技有限公司。將人工表皮模型從營(yíng)養(yǎng)瓊脂轉(zhuǎn)移到加有2 ml維持培養(yǎng)基的12孔板里，放入37℃， 5.0% CO2的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過(guò)夜，第2日更換培養(yǎng)基用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、紅色毛癬菌的標(biāo)準(zhǔn)株T1a

紅色毛癬菌的標(biāo)準(zhǔn)株T1a，由中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC，China Medical Culture Collection，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院南京皮膚病研究所）贈(zèng)予。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)測(cè)序和核糖體RNA大亞基D1-D2區(qū)序列分析鑒定為紅色毛癬菌。

三、主要試劑與儀器

維持培養(yǎng)基購(gòu)自上海斯安諾生物科技有限公司，馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基購(gòu)于英國(guó)Oxoid，氯化鈉購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑場(chǎng)，Whatman 濾紙購(gòu)自英國(guó)Whatman。生物安全柜購(gòu)自江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific，超速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特。

四、方 法

1.感染模型構(gòu)建

感染模型的構(gòu)建參考既往研究成果[9]。紅色毛癬菌T1a接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)14 d，連續(xù)活化2次以上，每管加入3 ～ 4 ml的0.85%無(wú)菌生理鹽水，用接種環(huán)輕輕刮取菌落表面，收集孢子和菌絲的混合懸液。用11 μm孔徑的無(wú)菌Whatman濾紙過(guò)濾得到孢子懸液。用0.85%無(wú)菌生理鹽水清洗2次，4 000 rpm，離心10 min，棄去上清液，加適量0.85%無(wú)菌生理鹽水重懸沉淀的孢子。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，制成終濃度分別為8×104 cfu/ml的孢子懸液備用。在人工表皮的中央垂直加入5 μl混勻的孢子懸液（400個(gè)孢子）構(gòu)建感染模型，加等量的無(wú)菌生理鹽水作陰性對(duì)照。37℃，5% CO2培養(yǎng)，每2 d更換維持培養(yǎng)基。

2.人工表皮角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

RNA提?。焊腥竞?6 h，分離人工表皮，采用Trizol法提取總RNA，隨后使用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。本研究中采用RPKM（Reads Per Kilobase Millon mapped reads）來(lái)表示基因表達(dá)量水平，我們采用|log2 fold change|≥1并且q≤0.05作為篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用The Go 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Go分析，通過(guò)Kegg數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行kegg分析，通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作（ppi）分析[10-13]。

結(jié)果

一、紅色毛癬菌感染后人工表皮角質(zhì)形成細(xì)胞基因表達(dá)的變化

在人工表皮受到紅色毛癬菌感染后，我們將人工表皮進(jìn)行RNA-seq分析，RNA-seq結(jié)果的熱圖。我們共篩選出了1 564個(gè)差異表達(dá)基因，包括1 102個(gè)上調(diào)基因與462個(gè)下調(diào)基因。在這些差異表達(dá)基因中我們發(fā)現(xiàn)了2個(gè)具有抗真菌感染作用的基因即Septin-7（上調(diào)了2.6倍）和Annexin-A1（上調(diào)了2.4倍）。

二、紅色毛癬菌感染后人工表皮角質(zhì)形成細(xì)胞差異表達(dá)基因的Go分析

為了了解差異表達(dá)基因的功能，我們將差異表達(dá)基因進(jìn)行了Go功能分析，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。Go分析結(jié)果主要富集于可能與應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染相關(guān)的生物學(xué)調(diào)控、膜及膜組分和催化功能。

三、紅色毛癬菌感染后人工表皮角質(zhì)形成細(xì)胞差異表達(dá)基因的kegg分析

為了了解差異表達(dá)基因所參與的信號(hào)通路，我們將差異表達(dá)基因進(jìn)行了kegg分析，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

四、紅色毛癬菌感染后人工表皮角質(zhì)形成細(xì)胞差異表達(dá)基因的ppi分析

為了篩選人工表皮角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染的關(guān)鍵基因，我們將差異表達(dá)基因進(jìn)行ppi分析。PHLPP2和TOP2B這2個(gè)基因具有最高度值，可能是角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染的關(guān)鍵基因。

討論

以往主要是通過(guò)大鼠、豚鼠等動(dòng)物感染模型以及角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚癬菌的共培養(yǎng)模型進(jìn)行皮膚癬菌病發(fā)病機(jī)制研究[16-18]。但是對(duì)于紅色毛癬菌研究以上2種模型都有一定的局限性。首先，紅色毛癬菌是典型的親人性皮膚癬菌，自然條件下極少感染小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，人類(lèi)和動(dòng)物對(duì)紅色毛癬菌不同的免疫應(yīng)答被認(rèn)為是導(dǎo)致紅色毛癬菌感染種屬差異的重要原因。因此動(dòng)物感染模型不是研究紅色毛癬菌感染免疫機(jī)制的最佳選擇。其次，普通的共培養(yǎng)模型中紅色毛癬菌直接浸泡生長(zhǎng)于培養(yǎng)基中和感染人體時(shí)主要在角質(zhì)層中生長(zhǎng)不同，因此通過(guò)上述模型得出的結(jié)論仍有一定的偏差。因此我們采用由人角質(zhì)形成細(xì)胞三維培養(yǎng)形成的人工表皮，感染紅色毛癬菌來(lái)構(gòu)建感染模型。此模型中，紅色毛癬菌在角質(zhì)層中侵襲生長(zhǎng)，而表皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞維持大致正常的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，完全符合紅色毛癬菌感染的病理表現(xiàn)并且很好地克服了由物種差異導(dǎo)致的研究偏差[9]。

近年來(lái)，除本課題組外，還有數(shù)個(gè)研究通過(guò)構(gòu)建皮膚癬菌感染人工表皮的模型，來(lái)開(kāi)展皮膚癬菌病發(fā)病機(jī)制的研究。這些研究接種的菌量明顯高于我們的研究，模型中大量的菌絲直接侵襲表皮全層，破壞了角質(zhì)形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)，這和真實(shí)的臨床紅色毛癬菌感染情況不符，因此我們認(rèn)為由此類(lèi)模型得出的研究結(jié)果可能有一定的偏差。因?yàn)榻琴|(zhì)形成細(xì)胞在受到破壞的情況下，其損傷識(shí)別受體可以識(shí)別損傷相關(guān)分子模式，進(jìn)而激發(fā)一系列繼發(fā)于角質(zhì)形成細(xì)胞損傷導(dǎo)致的信號(hào)通路激活、炎癥因子分泌。干擾角質(zhì)形成細(xì)胞針對(duì)紅色毛癬菌感染原發(fā)免疫相關(guān)機(jī)制的研究。

我們共篩選出了1 564個(gè)差異表達(dá)基因，包括1 102個(gè)上調(diào)基因與462個(gè)下調(diào)基因。在這些差異表達(dá)基因中上調(diào)基因占大多數(shù)，而下調(diào)基因只占少部分，這反映人工表皮角質(zhì)形成細(xì)胞可能上調(diào)某些基因來(lái)應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌的感染。有研究表明Septin-7可以在內(nèi)皮細(xì)胞中形成內(nèi)吞白假絲酵母菌的復(fù)合物[14]。Annexin-A1表達(dá)于口腔上皮細(xì)胞，在正常條件下具有抗白假絲酵母菌感染功能[15]。在這些差異表達(dá)基因中我們發(fā)現(xiàn)了2個(gè)具有抗真菌感染作用的基因Septin-7和Annexin-A1，Septin-7上調(diào)了2.6倍，Annexin-A1上調(diào)了2.4倍，說(shuō)明它們可能在應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染中具有重要的作用。

我們通過(guò)感染模型的構(gòu)建以及RNA-seq分析，得到了人角質(zhì)形成細(xì)胞在應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)，再通過(guò)Go、kegg以及ppi分析了解這些差異表達(dá)基因的功能。差異表達(dá)基因主要富集于賴(lài)氨酸降解、磷酸肌醇代謝以及大腸腫瘤相關(guān)通路。目前還沒(méi)有研究表明這些通路與抗真菌感染直接相關(guān)。值得注意的是，富集的通路中并沒(méi)有免疫通路，這可能說(shuō)明了人角質(zhì)形成細(xì)胞識(shí)別紅色毛癬菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力不足，符合臨床上紅色毛癬菌感染炎癥輕微的特性。

值得注意的是，ppi分析中2個(gè)度值最高的基因PHLPP2和TOP2B可能在角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染中扮演著重要的作用。據(jù)報(bào)道，抑制PHLPP2的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致c-JUN的激活，并最終提升TNF-α的表達(dá)水平[19]。

綜上所述，深入研究人角質(zhì)形成細(xì)胞應(yīng)對(duì)紅色毛癬菌感染的基因表達(dá)差異，對(duì)于探究皮膚癬菌發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)更有效的皮膚癬菌病防治藥物和方法都顯得尤為重要。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2018-12-08）

（本文編輯：楊江瑜）