高麗麗?張亦瑾?高學(xué)松?李洪杰?劉楠?高萍?徐琍?段雪飛

【摘要】目的 探討HCBP6在原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）患者中的表達(dá)及意義。方法 收集PBC患者血清標(biāo)本60例（PBC血清組）、取10名同期健康體檢者外周血標(biāo)本為正常對照組1，采用ELISA法檢測血清HCBP6水平。收集肝穿刺標(biāo)本40例（PBC肝組織組）、取10例肝移植供肝組織標(biāo)本作為正常對照組2，采用免疫組織化學(xué)染色檢測肝組織HCBP6表達(dá)，分析HCBP6與肝組織病理分期的相關(guān)性。結(jié)果 PBC血清組HCBP6水平較正常對照組1低（P < 0.05）。PBC肝組織組中的HCBP6陽性細(xì)胞數(shù)量較正常對照組2少（P < 0.01），與肝組織病理分期呈負(fù)相關(guān)（rs = -0.583，P < 0.001）。結(jié)論 HCBP6在PBC患者外周血和肝組織中均呈低表達(dá)，提示HCBP6可能在PBC的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】HCBP6;原發(fā)性膽汁性膽管炎;病理分期

Expression and clinical significance of HCBP6 in patients with primary biliary cholangitis Gao Lili， Zhang Yijin， Gao Xuesong， Li Hongjie， Liu Nan， Gao Ping， Xu Li， Duan Xuefei. Department of General Med-icine， Beijing Ditan Hospital， Capital Medical University， Beijing 100015， China

Corresponding author， Duan Xuefei， E-mail： duanxuefei@ vip. sina. com

【Abstract】Objective To investigate the expression and clinical significance of hepatitis C virus core-binding protein 6 （HCBP6） in patients with primary biliary cholangitis（PBC）. Methods A total of 60 serum specimens from PBC patients （PBC serum group） and 10 peripheral blood specimens from healthy subjects （normal control group 1）were collected. The level of serum HCBP6 was determined by ELISA. Forty liver tissue specimens from PBC patients （PBC liver tissue group）via liver biopsy and 10 normal donor liver specimens from liver transplantation （normal control group 2）were collected. The expression level of HCBP6 in the liver tissues was detected by immunohistochemistry. The correlation between HCBP6 and the pathological staging of liver tissues was analyzed. Results The level of serum HCBP6 in the PBC serum group was significantly down-regulated than that in the normal control group 1（P < 0.05）. The quantity of HCBP6-positive cells in liver tissues of PBC liver tissue group was significantly less compared with that in the normal control group 2 （P < 0.01）. It was nagatively correlated the pathological staging （rs = -0.583，P < 0.001）. Conclusion HCBP6 is lowly expressed in the peripheral blood and liver tissues of PBC patients， prompting that HCBP6 probably plays a pivotal role in the pathogenesis of PBC.

【Key words】Hepatitis C virus core-binding protein 6;Primary biliary cholangitis;

Pathological staging

原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）又稱原發(fā)性膽汁性肝硬化，是一種由自身免疫介導(dǎo)的慢性肝病，中老年女性為好發(fā)人群。臨床上以慢性膽汁淤積、血清抗線粒體抗體（AMA）陽性、IgM升高、肝臟生化指標(biāo)異常為特征，病理上主要表現(xiàn)為肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性非化膿性破壞性炎癥，可慢性進(jìn)展至肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化[1]。關(guān)于PBC的發(fā)病機(jī)制，目前沒有定論，除遺傳、環(huán)境等因素以外，多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、基因均參與了疾病的發(fā)生。

丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合蛋白6（HCBP6）又名FUNDC2、HCC3、DC44 PD03104，是由我們課題組通過酵母雙雜交技術(shù)篩選并命名的一個基因。其可以與丙型肝炎病毒核心蛋白結(jié)合，生物學(xué)功能尚不十分明確[2]。課題組初步的研究表明，HCBP6在甘油三酯代謝過程中發(fā)揮重要作用[3]。近期有研究認(rèn)為代謝綜合征在PBC的發(fā)病及疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，提示與甘油三酯代謝密切相關(guān)的HCBP6可能在PBC的發(fā)病及疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[4]。本研究主要檢測PBC患者與正常對照者之間血清和肝組織中HCBP6的表達(dá)差異，分析HCBP6與臨床相關(guān)指標(biāo)、肝組織的病理分期之間的關(guān)系，進(jìn)而闡述HCBP6在PBC發(fā)生發(fā)展中可能的作用。

對象與方法

一、研究對象

選取2015年1月至2019年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院確診的PBC患者60例。PBC的診斷主要依據(jù)2018年美國肝病研究學(xué)會（AASLD） 更新的PBC診斷和治療指南，需符合3項(xiàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)中的2項(xiàng)：AMA陽性;提示膽汁淤積的生化學(xué)表現(xiàn);組織學(xué)表現(xiàn)為非化膿性破壞性膽管炎和小葉間膽管損傷[5]。排除合并其他自身免疫性肝病、系統(tǒng)自身免疫性疾病、各種急慢性病毒性肝炎、半年內(nèi)使用可疑肝損傷藥物、長期大量飲酒及臨床資料不完整者。60例PBC患者外周血標(biāo)本作為PBC血清組，另選取10名同期健康體檢者外周血標(biāo)本作為正常對照組1。

選取2015年1月至2019年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院PBC患者肝穿刺標(biāo)本40例（PBC肝組織組），PBC患者入組標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)同上。病理分期主要依據(jù)Scheuer評分系統(tǒng)：小膽管炎期為Ⅰ期，細(xì)小膽管增生期為Ⅱ期，瘢痕期為Ⅲ期，肝硬化期為Ⅳ期[6]。各病理分期PBC患者各10例，另選同期10名肝移植供肝組織的肝穿刺標(biāo)本為正常對照組2。研究方案獲首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

二、方 法

1.主要試劑

用于ELISA的試劑盒購自武漢艾伯維公司，兔抗人HCBP6抗體購自臺灣Anova公司，Dako REAL EnVision 免疫組化檢測試劑盒購自美國Dako公司。

2. ELISA法測定血清HCBP6水平

PBC血清組、正常對照組1的外周靜脈血5 ml，2 h內(nèi)1000 ×g離心10 min，取上層血清，并保存于-80℃，依據(jù)ELISA試劑盒的方法檢測血清HCBP6的表達(dá)水平，具體步驟參照試劑盒說明書。

3.肝組織HCBP6免疫組織化學(xué)（組化）染色

PBC肝組織組、正常對照組2的肝組織標(biāo)本用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，以4 μm厚連續(xù)切片，以二甲苯、乙醇梯度脫蠟。磷酸鹽緩沖液洗滌3次，由3% H2O2作用15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。再由檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)15 min，自然緩慢冷卻至室溫。由羊血清在室溫下封閉30 min后滴加兔抗人HCBP6抗體（濃度為1∶100），4℃過夜。次日再滴加二抗，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯色后蘇木精復(fù)染，然后中性樹膠封片。最后在顯微鏡下（×400）隨機(jī)選取5個門管區(qū)，主要計(jì)數(shù)每個門管區(qū)的陽性細(xì)胞數(shù)量，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 ? ? ? ? ? ? ?肝組織標(biāo)本免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)

項(xiàng) 目 0 1 2 3

陽性細(xì)胞比例（%） 0% < 30% 30% ～ 70% > 70%

染色強(qiáng)度 陰性 弱 中 強(qiáng)

注：總分為陽性細(xì)胞比例的得分加上其免疫組化染色強(qiáng)度的得分，即得到其總分為0、2、3、 4、5或6;0 為（-），2為（+），3 ～ 4為（++），5 ～ 6 為（+++）

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間比較采用Fisher確切概率法。等級資料間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、一般資料比較

PBC血清組共60例，其中男6例、女54例，年齡 （46.8±8.8）歲;正常對照組1共10例，男2例、女8例，年齡 （50.2±9.6）歲。PBC血清組與正常對照組1的性別構(gòu)成、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。

PBC肝組織組40例，其中男5例、女35例，年齡 （43.0±10.5）歲。Ⅰ期10例，其中男1例、女9例，年齡（30.5±11.7）歲。Ⅱ期10例，其中男2例、女8例，年齡（40.2±10.6）歲。Ⅲ期10

例，其中男1例、女9例，年齡（39.6±12.8）歲。Ⅳ期10例，其中男1例、女9例，年齡（41.4± 8.4）歲。正常對照組2共10名，其中男2名、女8名，年齡 （32.3±12.6）歲。PBC肝組織各分期組之間與正常對照組2的性別構(gòu)成、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。

二、PBC血清組與正常對照組1的HCBP6水平表達(dá)比較

PBC血清組HCBP6水平比正常對照組1低（t = 6.815，P < 0.001），見圖1。

三、PBC肝組織各分期組與正常對照組2的臨床特征、肝組織HCBP6表達(dá)差異及其與病理分期的相關(guān)性

與正常對照組相比，PBCⅠ期、PBCⅡ期、PBCⅢ期、PBCⅣ期的白蛋白、甘油三酯差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）;PBCⅠ期、PBCⅢ期、PBCⅣ期血小板差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）;PBCⅢ期、PBCⅣ期膽紅素、總膽固醇差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）。與PBCⅠ期相比，PBCⅡ期、PBCⅢ期總膽固醇、甘油三酯差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）;PBCⅢ期、PBCⅣ期白蛋白差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）;PBCⅣ期膽紅素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。PBCⅡ期相比，PBCⅣ期甘油三酯差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見表2。

免疫組化的染色結(jié)果顯示，HCBP6陽性染色主要定位于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色，細(xì)胞核中有少量染色。PBC患者中HCBP6陽性的細(xì)胞較正常肝組織明顯減少，正常對照組2與PBC肝組織各分期組間HCBP6陽性細(xì)胞數(shù)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.01），見圖2、表3。秩相關(guān)分析顯示，HCBP6陽性細(xì)胞數(shù)量與肝組織病理分期呈負(fù)相關(guān)（rs = -0.583，P < 0.001）。

討論

原發(fā)性膽汁性肝硬化是一種自身免疫介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性膽汁淤積性肝病，其病理特征為慢性進(jìn)行性小葉間膽管的破壞性炎癥改變，同時伴隨小膽管增生，肝內(nèi)結(jié)締組織增生，最終形成肝硬化。其主要臨床表現(xiàn)為門脈高壓和肝功能衰竭[7]。

關(guān)于PBC的發(fā)病原因，目前大多學(xué)者認(rèn)為與自身免疫反應(yīng)相關(guān)，遺傳因素是主要的決定因素。另外雌激素、性染色體、泌尿道或陰道感染及環(huán)境因素也是重要的發(fā)病因素[8-16]。目前有研究認(rèn)為代謝綜合征在PBC的發(fā)病及疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[4]。而甘油三酯代謝異常是引發(fā)代謝綜合征的重要因素，所以甘油三酯的代謝異常在PBC的發(fā)病和疾病進(jìn)展中有可能起到重要作用。我們的初步研究表明HCBP6可下調(diào)甘油三酯，并隨甘油三酯的升高而上調(diào)[3]。提示我們HCBP6可能在PBC的發(fā)病及病程進(jìn)展中起重要作用。而我們的本次研究證實(shí)了這個觀點(diǎn)。通過比較健康人與PBC患者血清及組織中HCBP6的表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)PBC患者中HCBP6的含量明顯下降，提示HCBP6可能參與了PBC的發(fā)病。

關(guān)于代謝綜合征在PBC發(fā)病及進(jìn)展中的機(jī)制尚無相關(guān)研究。那HCBP6在PBC發(fā)病中的作用機(jī)制又是怎樣的呢？近期美國和意大利合作開展了一項(xiàng)多中心的研究給了我們一些提示[17]。這項(xiàng)研究選擇同卵雙胞胎，而在雙胞胎中一個患有PBC，另一個沒有PBC，利用全基因組研究分析2組的基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCBP6的啟動子甲基化與PBC的發(fā)病相關(guān)。而近期Gershwin團(tuán)隊(duì)的研究又證實(shí)了上述結(jié)論，他們認(rèn)為PBC患者中CD8+ T淋巴細(xì)胞的HCBP6啟動子存在高甲基化狀態(tài)，并且這種高甲基化與PBC的發(fā)病相關(guān)[18]。這都提示我們HCBP6在PBC的發(fā)病中的作用機(jī)制可能是啟動子的甲基化，這將是我們下一步的研究內(nèi)容。

綜上所述，HCBP6可能在PBC的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，然而其作用機(jī)制是否為通過啟動子甲基化，目前尚待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-08-06）

（本文編輯：楊江瑜）