許杰華?張桂雄?楊敏?黃文山

【摘要】目的 探討用氯氨T法和Iodogen法進(jìn)行適配子的131I標(biāo)記的可行性及標(biāo)記產(chǎn)物在不同條件下的穩(wěn)定性。方法 用氯氨T法和Iodogen法分別對(duì)適配子進(jìn)行131I的標(biāo)記，用紙層析法測(cè)定2種方法不同反應(yīng)時(shí)間的標(biāo)記率，測(cè)定標(biāo)記產(chǎn)物在不同條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果 2種方法在反應(yīng)時(shí)間為1 min時(shí)的標(biāo)記率分別為（94.11±0.30） %和（94.01±0.07） %，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;置于4℃與室溫24 h后，標(biāo)記產(chǎn)物在磷酸鹽緩沖液（PBS）、無血清培養(yǎng)基、含10%血清培養(yǎng)基、純血清中的放射性化學(xué)純度分別為（97.46±0.77） %、（94.76±1.57） %、（85.18±2.27） %、（67.96±1.91） %與（95.78±1.98） %、（56.11±4.06） %、（23.96±3.76） %、（9.45±1.75） %，除PBE介質(zhì)外，標(biāo)記產(chǎn)物在4℃條件與室溫條件下的放射性化學(xué)純度均有差異（P均 < 0.001）;2種溫度條件下標(biāo)記產(chǎn)物在無血清培養(yǎng)基與含10%血清培養(yǎng)基中的放射性化學(xué)純度均有差異（P均 < 0.001）。結(jié)論 氯氨T法和Iodogen法均可高效標(biāo)記適配子，標(biāo)記產(chǎn)物在低溫及無血清條件中穩(wěn)定性更好。

【關(guān)鍵詞】適配子;氯氨T法;Iodogen法;131I;穩(wěn)定性

Optimization and evaluation of the stability of 131I labeling aptamer Xu Jiehua， Zhang Guixiong， Yang Min， Huang Wenshan. Department of Nuclear Medicine， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Xu Jiehua， E-mail： xujhgz3@163.com

【Abstract】Objective To investigate the feasibility of labeling aptamer with 131I using chloramine-T or Iodogen methods and evaluate its stability under different conditions. ?Methods Aptamer was labeled with 131I using the chloramine-T and Iodogen methods. The labeling rate of different reaction times were measured by paper chromatography. The stability of labeled products under different conditions was determined. Results The labeling rates of two methods at 1 min of reaction time were （94.11±0.30） % and （94.01±0.07） %， respectively， there was no significant difference between them （P > 0.05）. The radiochemical purity of labeled products in phosphate buffer（PBS）， serum-free medium， 10% serum medium and serum were （97.46±0.77） %， （94.76±1.57） %， （85.18±2.27） % and （67.96±1.91） % at 4℃for 24 h， （95.78 ±1.98） %， （56.11±4.06） %， （23.96±3.76） % and （9.45±1.75） % at room temperature for 24 h， respectively. Statistical significance was observed under two temperature conditions in serum-free medium， 10% serum medium and serum （all P < 0.001）. At 44℃ and room temperature， the radiochemical purity of labeled products in the serum-free medium and 10% serum medium significantly differed （both P < 0.001）. Conclusion Both chloramine-T and Iodogen methods can efficiently label the aptamer， and the labeling products have better stability under low temperature and serum-free conditions.

【Key words】Aptamer;Chloramine-T;Iodogen;131I;Stability

寡核苷酸適配子（aptamer）是用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)，通過體外篩選、擴(kuò)增和富集獲得能與多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、核酸以及細(xì)胞和組織等靶物質(zhì)高親和力、高特異性結(jié)合的單鏈DNA/RNA寡核苷酸[1-3]。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中利用基于細(xì)胞的SELEX技術(shù)（Cell-SELEX技術(shù)）篩選出多條對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株具有高度靶向性及親和力的適配子JHIT1 ～ JHIT7 （ssDNA），其中JHIT2的親和力最佳，然后對(duì)適配子JHIT2用Iodogen法進(jìn)行131I的直接標(biāo)記，但該法的標(biāo)記率較低且穩(wěn)定性較差[4-5]。在適配子篩選的過程中，我們對(duì)適配子進(jìn)行了熒光標(biāo)記[羧基熒光素（FAM）、FITC、Cy5等]用于流式細(xì)胞技術(shù)及體外熒光顯像試驗(yàn)以探討其靶向性與親和力。適配子的熒光標(biāo)記簡(jiǎn)單易行，可由公司直接合成及純化。在這過程中，我們發(fā)現(xiàn)適配子連接上功能基團(tuán)FAM后，F(xiàn)AM可提供多個(gè)131I標(biāo)記的位點(diǎn)，為標(biāo)記提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，預(yù)計(jì)該法的標(biāo)記效率會(huì)比直接標(biāo)記法高。在本研究中，我們將在前期研究中篩選出的適配子JHIT2的末端連接上功能基團(tuán)FAM，分別用氯氨T法及Iodogen法對(duì)其進(jìn)行131I標(biāo)記，比較2種標(biāo)記法的標(biāo)記效能，并研究其標(biāo)記產(chǎn)物在不同條件下的穩(wěn)定性，為適配子介導(dǎo)肝癌的靶向放射顯像或靶向放射治療奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液（PBS，江蘇產(chǎn)），無載體Na131I溶液（廣東產(chǎn)）;Pierce Pre-Coated 碘化管（美國(guó)產(chǎn)），SephadexG-25、氯氨T （上海產(chǎn)），偏重亞硫酸鈉（廣東產(chǎn)），3MM色譜層析濾紙（英國(guó)產(chǎn)），玻璃毛細(xì)管（0.3 × 100 mm，四川產(chǎn)），GC-1200 γ放射免疫計(jì)數(shù)器（安徽產(chǎn)）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.功能基團(tuán)FAM與肝癌適配子JHIT2的連接

適配子JHIT2 （序列為5-AGAGACCCTGACTGCGAACCCAATCGCACCACATCTCAACATGTGGACACGGTGGCTTCTT-3）的5末端連接上功能基團(tuán) FAM構(gòu)成FAM-JHIT2;適配子JHIT2及FAM-JHIT2均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并經(jīng)過高效液相色譜法（HPLC）純化。

2. 131I標(biāo)記FAM-JHIT2

2.1 氯氨T法

由低溫冰箱中取出FAM-JHIT2 33 μg，5000

轉(zhuǎn)/分離心2 min使其沉淀，然后加入100 μl PBS備用。在1 ml試管中依次加入FAM-JHIT2、50 μl （約

5.2 MBq）的Na131I溶液及50 μl氯氨T （1 mg/ml），充分混勻，在室溫下反應(yīng)0.5、1、2、4、8 min后加入50 μl的偏重亞硫酸鈉（2 mg/ml）終止反應(yīng)。

2.2 Iodogen法

由低溫冰箱中取出FAM-JHIT2 33 μg，5000 轉(zhuǎn)/分離心2 min使其沉淀，然后加入100 μl PBS備用。在Pre-Coated碘化管中依次加入FAM-JHIT2、5.2 MBq的Na131I溶液，充分混勻，在室溫下反應(yīng)0.5、1、2、4、8 min后取出反應(yīng)液即可終止反應(yīng)。

3.氯氨T法及 Iodogen法標(biāo)記率測(cè)定

用紙層析法測(cè)標(biāo)記率，以色譜層析濾紙（2 cm×16 cm）為固定相，用毛細(xì)管取標(biāo)記完成的溶液3 ～ 5 μl點(diǎn)樣于層析紙的原點(diǎn)處，以甲醇∶水為85∶15為展開劑進(jìn)行紙層析。將層析后的紙條每隔1 cm剪開，測(cè)定每小段的放射性計(jì)數(shù)。標(biāo)記率（%） = 產(chǎn)品峰的放射性計(jì)數(shù)/（產(chǎn)品峰的放射性計(jì)數(shù)+游離131I 峰的放射性計(jì)數(shù)）×100%。

4.標(biāo)記產(chǎn)物的純化及放射性化學(xué)純度測(cè)定

用經(jīng)PBS平衡后的SephadexG-25柱（中顆粒，柱規(guī)格0. 5 cm×10 cm）進(jìn)行離心（1200 轉(zhuǎn)/分，5 min）純化，用蒸餾水洗脫，洗脫液用試管收集。放射性化學(xué)純度用紙層析法測(cè)定，方法與標(biāo)記率測(cè)定相同。

5.標(biāo)記產(chǎn)物的體外穩(wěn)定性

將純化后的標(biāo)記產(chǎn)物（740 KBq， 50 μl）以體積比為1∶1的比例分別與PBS、無血清培養(yǎng)基、含10 %血清的培養(yǎng)基、純血清混合，分別置于4℃及室溫下于1、2、4、8、12、24 h后用紙層析法測(cè)定其放射性化學(xué)純度，比較其在不同條件下的穩(wěn)定性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 ～ 4次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用GraphPad Prism 6處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、FAM與適配子JHIT2的連接

適配子JHIT2的5末端連接上功能基團(tuán)FAM獲得FAM-JHIT2，見圖1。

二、氯氨T法及 Iodogen法標(biāo)記FAM-JHIT2的標(biāo)記率和放化純度

對(duì)比游離131I空白對(duì)照在層析紙上的遷移情況，可知第一峰為131I標(biāo)記FAM-JHIT2后的標(biāo)

記產(chǎn)品峰（相對(duì)遷移率Rf 0 ～ 0.1），第二峰為游

離的131I 峰（相對(duì)遷移率Rf 0.8 ～ 0.9），見圖2。氯氨T法室溫下反應(yīng)0.5、1、2、4、8 min后的標(biāo)記率分別為（93.29±0.84） %、（94.11±0.30） %、

（93.85±0.22） %、（93.05±0.72） %、（84.70 ±2.58） %，見圖3A。Iodogen法室溫下反應(yīng)0.5、1、2、4、8 min后的標(biāo)記率分別為（92.12±0.18） %、

（94.01±0.07） %、（93.47±0.21） %、（90.95 ±0.18） %、（81.26±2.77） %，見圖3B。2種標(biāo)記

方法的標(biāo)記效能無差異（P > 0.05），且均在1 min

反應(yīng)時(shí)間時(shí)標(biāo)記率最高。因Iodogen法采用的Pierce Pre-Coated 碘化管不易購買且較貴，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用氯氨T進(jìn)行131I 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)SephadexG-25柱純化后放射性化學(xué)純度為（98.55±0.08） %。

三、不同溶液和溫度條件下標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性

24 h后在PBS介質(zhì)中，4℃條件與室溫條件下標(biāo)記產(chǎn)物的放射性化學(xué)純度無差異（P > 0.05）。在無血清培養(yǎng)基、含10%血清培養(yǎng)基及純血清3種介質(zhì)中，4℃條件與室溫條件下標(biāo)記產(chǎn)物的放射性化學(xué)純度均有差異（P均 < 0.001）。4℃條件與室溫條件下標(biāo)記產(chǎn)物在無血清培養(yǎng)基與含10%血清培養(yǎng)基中的放射性化學(xué)純度均有差異（P均 < 0.001），見表1。

討論

寡核苷酸適配子具有類抗體作用，且可克服抗體的多項(xiàng)缺點(diǎn)，是一種具有應(yīng)用前景的新型分子靶向探針。與抗體相比，寡核苷酸適配子具有靶分子范圍廣泛、特異性高、親和力強(qiáng)、易于人工合成、穩(wěn)定性好、易修飾、無毒性和缺乏免疫原性等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[2-3]。自適配子問世以來，已有不少關(guān)于適配子介導(dǎo)核素進(jìn)行體內(nèi)外放射性核素顯像或治療的研究報(bào)道。例如，Jacobson等[6]利用點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)進(jìn)行適配子的18F標(biāo)記，合成由適配子介導(dǎo)的18F顯像探針，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得較好的顯像效果;Varmira等[7]利用99mTc標(biāo)記的靶向人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER2）的適配子進(jìn)行單光子發(fā)射及X射線計(jì)算機(jī)斷層成像系統(tǒng)（SPECT/CT）顯像研究等。Zhu等（2015年）指出，131I為臨床常用核素，其具有較長(zhǎng)的半衰期（T1/2 = 8.01 d），可發(fā)射γ射線用于SPECT成像和發(fā)射β射線用于放射治療，且其標(biāo)記方法簡(jiǎn)單易行，標(biāo)記產(chǎn)物穩(wěn)定，在實(shí)驗(yàn)研究中已被廣泛應(yīng)用。

適配子JHIT2本質(zhì)是一條含有61個(gè)核苷酸的單鏈DNA。之前已有多項(xiàng)關(guān)于125I（或131I）標(biāo)記核苷酸鏈的研究[李丹等（2010年）、歐曉紅等（2006年）、王榮福等（2004年）、劉生等（2004年）的研究]，但存在直接標(biāo)記的標(biāo)記效率低下和穩(wěn)定性差或標(biāo)記時(shí)需要連接螯合劑導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過程煩瑣等缺點(diǎn)。本研究以本課題組前期實(shí)驗(yàn)中篩選出的適配子 JHIT2為基礎(chǔ)，在其末端連接上功能基團(tuán)FAM為131I標(biāo)記提供位點(diǎn)，避免對(duì)適配子鏈進(jìn)行直接標(biāo)記而導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的破壞，并提高標(biāo)記效能和標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，氯氨T法和Iodogen法的標(biāo)記率在反應(yīng)時(shí)間4 min內(nèi)較佳，可達(dá)90%以上;其中反應(yīng)時(shí)間為1 min時(shí)，標(biāo)記率最好，可達(dá)94%以上，遠(yuǎn)高于課題組前期實(shí)驗(yàn)中131I直接標(biāo)記適配子的標(biāo)記率（67.8±0.5）%和歐曉紅等（2006年）用131I直接標(biāo)記寡核苷酸鏈的標(biāo)記率（37.6±2.4）%。另外，標(biāo)記產(chǎn)物于PBS中24 h后放射性化學(xué)純度仍大于90%，且低溫可提高其穩(wěn)定性，有利于該標(biāo)記產(chǎn)物的保存和運(yùn)輸;標(biāo)記產(chǎn)物無論是在低溫或室溫條件下置于含血清的培養(yǎng)基或純血清時(shí)的穩(wěn)定性均降低，這可能是血清中含有的核酸酶對(duì)適配子鏈的降解所致，但低溫可抑制核酸酶的活性，從而減緩核酸鏈的降解，提高標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

綜上所述，在本研究中，我們通過在適配子的末端連接上功能基團(tuán)FAM提供多個(gè)131I標(biāo)記的位點(diǎn)，為131I的標(biāo)記提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，然后分別用氯氨T法和Iodogen法對(duì)其進(jìn)行131I標(biāo)記，結(jié)果顯示2種標(biāo)記方法均能獲得較高的標(biāo)記率，且反應(yīng)時(shí)間僅需1 min。標(biāo)記產(chǎn)物在無血清條件中穩(wěn)定性好，且低溫可提高標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。本研究為適配子介導(dǎo)的肝癌靶向放射顯像和放射治療奠定了基礎(chǔ)。我們將在之后的研究中探討131I標(biāo)記的適配子進(jìn)行靶向肝癌顯像的可能性，必要時(shí)對(duì)適配子進(jìn)行相應(yīng)的穩(wěn)定性修飾，提高其在血清中的穩(wěn)定性，以便更好地應(yīng)用于體內(nèi)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 楊婷，曹素娥，焦舉，鄒瓊，朱姝，張勇. 前列腺癌適配體的研究進(jìn)展. 新醫(yī)學(xué)， 2016，47（12）：789-796.

[2] Fang X， Tan W. Aptamers generated from cell-SELEX for molecular medicine： a chemical biology approach. Acc Chem Res， 2010，43（1）：48-57.

[3] Shangguan D， Li Y， Tang Z， Cao ZC， Chen HW， Mallikaratchy P， Sefah K， Yang CJ， Tan W. Aptamers evolved from live cells as effective molecular probes for cancer study. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006，103（32）：11838-11843.

[4] Xu J， Teng IT， Zhang L， Delgado S， Champanhac C， Cansiz S， Wu C， Shan H， Tan W. Molecular recognition of human liver cancer cells using dna aptamers generated. PLoS One， 2015，10（5）：e125810-e125863.

[5] 楊敏，黃文山，查悅明，張桂雄，許杰華. 131I標(biāo)記的肝癌核酸適配子在荷瘤裸鼠體內(nèi)生物分布及顯像. 中華肝臟外科手術(shù)學(xué)電子雜志， 2019，8（3）：260-264.

[6] Jacobson O， Weiss ID， Wang L， Wang Z， Yang X， Dewhurst A， Ma Y， Zhu G， Niu G， Kiesewetter DO， Vasdev N， Liang S H， Chen X. 18F-labeled single-stranded DNA aptamer for PET imaging of protein tyrosine kinase-7 expression. J Nucl Med， 2015，56（11）：1780-1785.

[7] Varmira K， Hosseinimehr SJ， Noaparast Z， Abedi SM. A HER2-targeted RNA aptamer molecule labeled with 99mTc for single-photon imaging in malignant tumors. Nucl Med Biol， 2013，40（8）：980-986.

（收稿日期：2019-06-22）

（本文編輯：洪悅民）