盧業(yè)明?麥志輝?陳正?陳琳?鄺志立?彭云?艾虹

【摘要】目的 研究正畸牙移動（OTM）過程中外周神經(jīng)對Wnt信號通路的調控以及它們在正畸成骨過程中的作用。方法 分別建立OTM模型和辣椒素去感覺神經(jīng)模型：將36只SD大鼠隨機分為不注射辣椒素+不進行牙移動組（對照組）、不注射辣椒素+牙移動組（牙移動組）、注射辣椒素+不進行牙移動（去神經(jīng)組）、注射辣椒素+牙移動（去神經(jīng)+牙移動組），每組各9只大鼠。使用逆轉錄定量 PCR（qRT-PCR）檢測移動牙周圍牙槽骨Wnt5a和Wnt10b的mRNA表達水平，通過免疫組織化學染色（免疫組化）檢測各組右側上頜第一磨牙牙根張力側Wnt5a和骨鈣素的表達變化。結果 在SD大鼠上進行OTM后，牙槽骨中Wnt5a和Wnt10b mRNA水平上調（P均< 0.05）。使用辣椒素去感覺神經(jīng)后，有OTM大鼠Wnt5a mRNA與無OTM大鼠相近（P > 0.05），而Wnt10b mRNA水平仍升高（P < 0.05）。免疫組化示，正常SD大鼠OTM 9 d后，張力側牙周膜內Wnt5a蛋白和成骨標志物骨鈣素蛋白表達水平上調（P均< 0.05），但辣椒素去感覺神經(jīng)后Wnt5a和骨鈣素蛋白表達水平被顯著抑制，與無OTM大鼠相近（P均> 0.05）。結論 感覺神經(jīng)在OTM誘導的骨改建過程中起著重要的作用。感覺神經(jīng)可能通過調控Wnt5a的表達而調控OTM中的骨改建過程。

【關鍵詞】感覺神經(jīng);正畸牙移動;Wnt通路

Peripheral sensory nerves regulate orthodontic tooth movement-induced bone formation via Wnt5a signaling pathway Lu Yeming， Mai Zhihui， Chen Zheng， Chen Lin， Kuang Zhili， Peng Yun， Ai Hong. Department of Stomatology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Peng Yun， E-mail： pengyun9@ mail. sysu. edu. cn; Ai Hong， E-mail： aih_zssy09@ 126. com

【Abstract】Objective To investigate whether peripheral sensory nerves regulate the Wnt signaling pathway and their potential roles in the bone formation during the process of orthodontic tooth movement （OTM）.? Methods SD rat models with OTM and sensory denervation with capsicin were established. Thirty-six SD rats were randomly and evenly divided into four groups： no capsaicin injection + no OTM group （control group）， no capsaicin injection + OTM group （OTM group）， capsaicin injection + no OTM group （denervation group） and capsaicin injection + OTM group （denervation + OTM group）. The expression levels of Wnt5a and Wnt10b mRNA in the alveolar bone were measured by qRT-PCR. The changes in the expression of Wnt5a and osteocalcin on the root tension side of the right maxillary first molar were measured by immunohistochemistry. Results The expression levels of Wnt5a and Wnt10b mRNA were significantly up-regulated after OTM in SD rats （both P < 0.05）. After sensory denervation with capsaicin， the expression of Wnt5a mRNA in SD rats with OTM was similar to that in SD rats without OTM （P > 0.05）， whereas the expression level of Wnt10b mRNA was significantly up-regulated （P < 0.05）. Immunohistochemistry revealed that the expression levels of Wnt5a and osteocalcin （osteogenic marker） proteins on the tension side were significantly up-regulated in normal SD rats at 9 d after OTM （both P < 0.05）， whereas remarkably down-regulated after sensory denervation with capsicin， which were similar to that in SD rats without OTM （both P > 0.05）. Conclusion Sensory nerves play a pivotal role in the OTM-induced bone formation， which probably modulate the bone formation during OTM by regulating the expression level of Wnt5a.

【Key words】Sensory nerve;Orthodontic tooth movement;Wnt signaling pathway

正畸牙移動（OTM）的基礎是牙槽骨的適應性改建，即壓力側主要發(fā)生骨吸收，張力側主要發(fā)生骨形成[1]。OTM具體的調控機制一直是正畸研究的熱門方向。近年來，不少文獻報道周圍神經(jīng)系統(tǒng)與骨改建密切相關[2]。通常交感神經(jīng)更多地參與破骨過程，而感覺神經(jīng)則與骨形成關系更密切。有學者使用高劑量辣椒素（150 mg/kg）去除感覺神經(jīng)后，大鼠肱骨近端的骨小梁體積和力學性能（強度、硬度等）下降[3]。另有學者觀察到注射辣椒素8周后，大鼠脛骨的骨小梁體積減少[4]。機械刺激能夠上調神經(jīng)生長因子（NGF）和感覺神經(jīng)中的NGF-TrkA信號，促進骨形成[5]。在OTM期間，牙周膜中降鈣素基因相關肽（CGRP）的表達增加[6]。骨髓間充質干細胞和成骨細胞也表達CGRP和P物質的受體[2， 7]。然而，感覺神經(jīng)調節(jié)骨改建的具體機制仍未被闡明。Wnt信號通路在成骨分化和骨形成中均起重要作用[8]。骨髓間充質干細胞轉染脂聯(lián)素后，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和細胞周期蛋白（cyclinD1）等Wnt/β-catenin信號通路相關的分子表達明顯上調，成骨分化和骨形成能力增強[9]。Wnt-16缺陷的小鼠則表現(xiàn)出低皮質骨厚度，高皮質孔隙率和自發(fā)性骨折[10]。機械力刺激能激活干細胞中的Wnt信號通路并促進成骨分化。給予牙周膜干細胞靜壓力刺激1 h后，Wnt/β-catenin信號通路激活，成骨分化能力增加[11]。在OTM期間，外周感覺神經(jīng)標志物CGRP在牙周膜中高度表達[6]。外周感覺神經(jīng)可能通過Wnt信號通路調控OTM骨形成，但其中具體機制仍有待闡明。本研究初步探討了外周感覺和Wnt信號通路在OTM骨形成過程中的作用，為OTM的具體機制提供一定的理論基礎。

材料與方法

一、OTM模型和去感覺神經(jīng)模型的建立

本實驗動物購于中山大學東校區(qū)實驗動物生產中心。將36只8周齡的雄性無特定病原體（SPF）級SD大鼠（200 ～ 220 g） 按隨機數(shù)字表法分成4組：不注射辣椒素+不進行牙移動組（對照組）、不注射辣椒素+牙移動組（牙移動組）、注射辣椒素+不進行牙移動組（去神經(jīng)組）、注射辣椒素+牙移動組（去神經(jīng)+牙移動組），每組各9只大鼠。每組其中3只大鼠用于實時熒光定量PCR檢測，其余用于免疫組織化學染色（免疫組化）檢測。根據(jù)Ding等[3]的方法建立去感覺神經(jīng)模型。辣椒素（Sigma，美國）溶于10%吐溫80+10%無水乙醇+80%生理鹽水中。對照組及牙移動組大鼠注射10%吐溫80+10%無水乙醇+80%生理鹽水。其他2組大鼠建立去神經(jīng)模型：每日注射辣椒素前，從上午10時至下午4時予禁水（防止辣椒素注射的并發(fā)癥），將辣椒素溶液注射到大鼠后頸部皮下，并將針頭留在皮下60 s以防止?jié)B漏。連續(xù)注射3 d，每日劑量分別為30、50、70 mg/kg。最后一次注射的7 d后，參照An等[12]的方法，在牙移動組、去神經(jīng)+牙移動組大鼠建立OTM模型：用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉大鼠。將鎳鈦彈簧安置于右上頜第一磨牙和上頜中切牙之間，并用不銹鋼結扎線固定，施加50 g正畸力。9 d后處死所有大鼠，取材用于逆轉錄定量 PCR（qRT-PCR）和免疫組化檢測。

二、qRT-PCR檢測

在OTM 9 d后取大鼠右上頜第一磨牙及其周圍牙槽骨，在液氮中研磨成粉末。使用Eastep? Super Total RNA Extraction試劑盒（Promega， 中國）提取總RNA，使用PrimeScriptTM RT Master Mix （Takara， 日本） 和SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ （Takara， 日本）進行逆轉錄和熒光定量，引物設計如表1所示。

表 1? ? ? ? ? ? ? ? ?qRT-PCR 引物序列

基 因 引 物 產物

長度

Wnt5a 正向5-CCACAAGAGACAGCTAGGGC-3 305 bp

反向5-AGAGCATGAGCCTTTTCGGT-3

Wnt10b 正向5-CCGTGAGTTAGGTCGAGCAG-3 202 bp

反向5-GTGGGGAAACTGTGTGGAGT-3

三、免疫組化

將掃描完的樣品用10%乙二胺四乙酸（EDTA，賽維爾，中國）脫鈣2個月，每3 d更換一次脫鈣液。脫鈣完成后，沿著矢狀面進行石蠟切片，以獲得完整的牙根和周圍的牙周組織，切片厚度為4 μm。用EDTA（百奧斯生物，中國）進行抗原修復，3%H2O2孵育20 min，10%山羊血清封閉20 min，一抗4℃孵育過夜。一抗如下：Wnt5a（Affinity，美國;1∶300）、骨鈣素（OCN，Arigo，中國;1∶1000）。使用HRP-山羊抗大鼠IgG二抗（antGene，中國）和Dako REALTM EnVisionTM Detection System試劑盒（DAKO，丹麥）進行二氨聯(lián)苯胺（DAB）染色。使用NanoZoomer S360（Hamamatsu，日本）掃描切片。使用Image Pro Plus 6.0測量右上頜第一磨牙根遠中牙周膜的平均光密度。

四、統(tǒng)計學處理

實驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)以表示。使用SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析。組間比較使用析因設計資料的方差分析，交互效應有統(tǒng)計學意義時，行單獨效應分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、去感覺神經(jīng)抑制OTM誘導的Wnt5a的表達

1. qRT-PCR結果

牙移動組大鼠進行了9 d的OTM后，其牙槽骨中Wnt5a mRNA表達上調（圖1A）。但去神經(jīng)+牙移動組大鼠處理9 d后Wnt5a表達無明顯變化，表明Wnt5a mRNA的表達受到感覺神經(jīng)的影響。析因設計資料方差分析顯示，兩因素間的交互效應有統(tǒng)計學意義（F = 17.197，P = 0.002），因此分析單獨效應，結果顯示牙移動組大鼠牙槽骨中Wnt5a mRNA表達高于去神經(jīng)+牙移動組（t = 6.835，P < 0.001）;去神經(jīng)組大鼠Wnt5a mRNA表達與去神經(jīng)+牙移動組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義（t = 1.237，P = 0.247）。無論是否去神經(jīng)，OTM后Wnt10b mRNA的表達均上調（圖1B），表明Wnt10b的表達不受感覺神經(jīng)的影響，析因設計資料方差分析結果表明，OTM的主效應有統(tǒng)計學意義，OTM大鼠Wnt10b mRNA表達高于無OTM大鼠（F = 22.471，P < 0.001）;去神經(jīng)的主效應無統(tǒng)計學意義（F = 1.317，P = 0.272）;兩因素間的交互效應無統(tǒng)計學意義（F = 0.001，P = 0.975）。

2. 免疫組化檢測結果

牙移動組大鼠的張力側牙周膜中Wnt5a 蛋白表達高于對照組;但去神經(jīng)+牙移動組大鼠的Wnt5a蛋白表達無上調。兩因素間的交互效應有統(tǒng)計學意義（F = 6.549，P = 0.018），因此分析單獨效應，結果顯示牙移動組大鼠張力側牙周膜中Wnt5a蛋白表達高于去神經(jīng)+牙移動組大鼠（t = 4.548，P < 0.001）;去神經(jīng)組大鼠Wnt5a蛋白表達與去神經(jīng)+牙移動組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義（t = 0.123，P = 0.903），見圖2。

二、去感覺神經(jīng)抑制張力側牙周膜內成骨標志物OCN的表達

牙移動組大鼠張力側牙周膜中OCN的表達高于對照組，表明張力側成骨活動增強。而去神經(jīng)+牙移動組大鼠牙周膜中OCN的表達無明顯變化。兩因素間的交互效應有統(tǒng)計學意義（F = 6.669，P = 0.016），因此分析單獨效應，結果顯示牙移動組大鼠張力側牙周膜中OCN蛋白表達高于去神經(jīng)+牙移動組大鼠（t = 3.721，P = 0.001）;去神經(jīng)組大鼠OCN蛋白表達與去神經(jīng)+牙移動組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義（t = 0.462，P = 0.648），見圖3。

討論

本研究初步探討了外周感覺神經(jīng)和Wnt信號通路在OTM中的作用，結果顯示OTM過程中Wnt5a表達上調，但去除感覺神經(jīng)后Wnt5a表達受到抑制，表明感覺神經(jīng)可能通過Wnt5a調控OTM骨改建過程。

Wnt5a和Wnt10b與機械力誘導的骨形成密切相關。MC3T3-E1受3400微應變處理5 h后，Wnt10b、SFRP1、cyclin D1、FzD2、WISP2和connexin 43基因的表達增加[13]。單軸機械張力可通過Wnt5a/Wnt5b/JNK信號通路促進大鼠肌腱干細胞的成骨分化[14]。因此，本研究選擇了Wnt5a和Wnt10b進行研究。

文獻報道，感覺神經(jīng)對骨改建起著重要作用，但是其分子機制尚不明確[2]。本研究顯示，去除感覺神經(jīng)以后，OTM不能上調Wnt5a的表達，且牙移動和去感覺神經(jīng)之間存在交互效應，提示感覺神經(jīng)可能通過Wnt5a調控OTM的骨改建過程。但骨改建過程中感覺神經(jīng)如何調控Wnt5a的表達尚未明確。CGRP和P物質都是感覺神經(jīng)重要的分泌物，它們都具有促進成骨分化和骨形成的作用[2]。用CGRP處理骨髓間充質干細胞后，Wnt信號通路相關分子發(fā)生明顯上調[8]。10-10 ～ 10-8 mol/L的P物質可以促進MC3T3-E1細胞的成骨分化，這種促進作用可被DKK1抑制，表明P物質通過Wnt信號通路促進成骨分化[15]。以上結果提示感覺神經(jīng)有可能通過CGRP和P物質調控Wnt5a的表達，我們將在日后的工作中進一步研究。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)去除感覺神經(jīng)會影響張力側成骨標志物OCN的表達水平，去神經(jīng)后牙周膜張力側OCN的表達不再隨著OTM的進行而上調，但Wnt5a如何調控骨的形成也有待于進一步研究。近年文獻報道，Wnt5a在成骨過程中可以激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路。Wnt5a可能通過Wnt/β-catenin調控成骨過程[16]。

綜上所述，外周感覺神經(jīng)可能通過Wnt5a調控OTM過程中的骨改建活動。本研究豐富了正畸的基礎理論，為快速安全地進行正畸治療提供了研究方向，有望減少長時間正畸治療帶來的不良反應[17]。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-09-10）

（本文編輯：林燕薇）