林星辰 田義新 王澤 牛林飛

摘要：研究人參內(nèi)生菌B69菌株在人參根、莖、葉及其根際土壤中的定殖規(guī)律，以及B69菌株對人參根腐病的防效，以期為新型人參根腐病生防制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。采用抗生素標記法，篩選出最佳標記菌株;采用盆栽和田間試驗測定自然土與無菌土處理下B69菌株在人參植株內(nèi)和根際土壤中的定殖能力。結(jié)果表明，標記菌株與未標記菌株在形態(tài)特征、拮抗能力、防病效果等方面無顯著差異;B69菌株能夠高效定殖在人參根部;B69菌株對人參根腐病有較好的防治效果，田間試驗結(jié)果表明該菌處理后的病情指數(shù)為25.41，對根腐病的相對防效為58.56%。說明B69菌株是有防治人參根腐病潛力的生防菌。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生細菌;B69菌株;定殖能力;人參根腐病;生物防治;生防制劑開發(fā)應(yīng)用

中圖分類號： S432.1? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0135-03

隨著植病防治策略的改變以及公眾對環(huán)境與健康問題的日益關(guān)注，生物殺菌劑的地位越來越重要[1-2]，但是進入產(chǎn)業(yè)化的品種很少，主要原因是生物殺菌劑的作用范圍一般比較窄等。微生物制劑的缺陷已經(jīng)受到研究人員的重視，并且致力于多功能微生物制劑的研究[3]。人參根腐病主要侵染人參的根部，造成根部軟化腐爛，植株萎蔫死亡[4]。人參根腐病致使人參產(chǎn)量、質(zhì)量大幅度下降，造成巨大經(jīng)濟損失。隨著人們對無公害食品的需求的日益增加以及對環(huán)境保護的日益關(guān)注，生物防治成為了人們控制植物病害的理想途徑[5-6]。因此，篩選出生物活性高、抗菌譜廣的菌株具有重要的意義。目前國內(nèi)外對番茄[7]、大蒜[8]、黃瓜[9]等植物生物防治的研究已經(jīng)取得了較大的進展，但對人參病害的生物防治還罕有報道。本研究從人參的根際土壤中篩選出1株對人參根腐病病原菌有極強拮抗作用的菌株B69，研究該菌株在人參的根、莖、葉和土壤的定殖規(guī)律及其對根腐病的盆栽和田間防治效果，以期為開發(fā)出具有應(yīng)用價值的生防菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 內(nèi)生細菌B69菌株由課題組從人參根中分離得到，經(jīng)鑒定為死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis），保存在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物栽培研究室。人參根腐病病原菌[Fusarium solani（Mart.） App. et Wollenw]，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究中心提供。

1.1.2 供試植株 人參根腐病防效試驗所用的人參植株采自吉林省白山市撫松縣萬良鎮(zhèn)，5年生。

1.1.3 供試培養(yǎng)基及其他試劑 供試細菌的保存和培養(yǎng)使用營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基;供試細菌液體發(fā)酵培養(yǎng)使用營養(yǎng)肉湯（NB）基礎(chǔ)培養(yǎng)基;病原真菌使用馬鈴薯葡萄糖（PDA）固體培養(yǎng)基;此外還使用了PDA液體培養(yǎng)基。試劑主要有 10 mg/mL 利福平（Rif）溶液（95%乙醇溶解），羧甲基纖維素鈉（CMC），10%多菌靈可濕性粉劑，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物栽培研究室提供。

1.1.4 試驗場地 人參田間試驗于2017年6—9月在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物科技示范園進行，采用一面坡式蔭棚遮蔭種植。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗利福平突變菌株的篩選 將活化好的拮抗細菌在32 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)2 d制成拮抗細菌種子液。取 10 mL 種子液接種在含 20 μg/mL Rif的NB培養(yǎng)液中。在 30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)4～5 d后，如果培養(yǎng)液變渾濁，則吸取10 mL接入Rif濃度為40 μg/mL的100 mL NB培養(yǎng)基中，以后每次培養(yǎng)液中Rif的濃度依次增加，直至標記至300 μg/mL，Rif的濃度分別為40、60、80、100、150、200、300 μg/mL。然后用含300 μg/mL Rif的NB培養(yǎng)基平板檢測并挑取能穩(wěn)定生長，且拮抗活性、菌落形態(tài)變化不大的標記菌株。為檢測其遺傳穩(wěn)定性，將其在NB培養(yǎng)基（不含Rif）中連續(xù)培養(yǎng)10代后涂布于含300 μg/mL Rif的NB培養(yǎng)基平板上，觀察是否能正常生長。為檢測其拮抗穩(wěn)定性，采用平板擴散法[10]，以原始菌株為對照，觀察抑菌率是否存在差異。

1.2.2 抗利福平標記菌株在人參土壤中的定殖 采用灌根接種法[11]，每盆3株，于第1天、第3天、第5天、第7天、第10天、第15天、第20天、第30天分離根際土壤的細菌，在含有 300 μg/mL 的利福平NA培養(yǎng)基平板中均勻涂布稀釋液，3 d 后計數(shù)，計算含菌量。

1.2.3 細菌在植株內(nèi)的定殖 采用灌根接種法[11]，用盆缽種植方式，分別于接菌后第7天、第10天、第15天、第20天、第30天時隨機取2株人參苗進行根部、莖、葉目標菌株的分離、回收。

1.2.4 內(nèi)生菌株B69對人參根腐病防效的盆栽試驗 盆栽試驗采用保護法和治療法，待人參展葉期時，采用灌根接種法接種B69菌株發(fā)酵菌液和根腐病病菌孢子懸浮液。保護法：先接種B69菌株發(fā)酵菌液，3 d后再接種3×104個/mL根腐病病菌孢子懸浮液;治療法：先接種3×104個/mL根腐病病菌孢子懸浮液，3 d后再接種B69菌株發(fā)酵菌液;以接種無菌發(fā)酵液為對照。每個處理5盆，每盆3株人參苗，20 d灌根1次，每株接種B69菌株發(fā)酵菌液的濃度為108 CFU/mL，接種量為 50 mL，共灌根5次。處理完成20 d后隨機取5株人參苗觀察根腐病發(fā)病情況，病情指數(shù)分級方法參考馬鳳茹等的方法[12]。

1.2.5 內(nèi)生菌株B69對人參田間病害的防治效果 田間試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，共設(shè)置4個處理，每個處理3個小區(qū)，小區(qū)面積為3.0 m2。處理1：單接病原菌;處理2：生防菌+病原菌;處理3：10%多菌靈可濕性粉劑+病原菌;處理4：未進行處理（CK）。待人參苗完全展葉后開始處理，處理1每個小區(qū)每株澆灌50 mL病原菌液;處理2每個小區(qū)每株澆灌 50 mL 根腐病病菌液+50 mL B69菌株發(fā)酵菌液;處理3和4每個小區(qū)噴施4 g/m2藥液或清水。每隔20 d處理1次，共處理5次。

人參田間試驗每個處理分別在7月5日、8月8日、9月10日調(diào)查3次，每個小區(qū)隨機選擇5點，每點調(diào)查10株，記錄總?cè)~片數(shù)和各葉片發(fā)病級數(shù)，計算出各處理的病情指數(shù)和防治效果。病害嚴重度分級，即人參根腐病發(fā)病程度參考馬鳳茹等的方法[12]進行分級計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗利福平突變菌株的篩選

通過對B69菌株進行抗利福平篩選，得到能在含利福平的NA固體培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長，且菌落形態(tài)、顏色等與原始菌株相同的突變菌株（圖1、圖2）;在不含利福平的NB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)后，其培養(yǎng)液對根腐病菌仍具有抑制作用，且與原始菌株的抑制效果基本相同。

2.2 抗利福平突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

挑取抗利福平的突變標記菌株，在不含利福平的NB液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)10代后，仍能在含利福平的NA固體培養(yǎng)基上生長（圖3、圖4），表明這株生防菌株的突變菌株具有遺傳穩(wěn)定性，可用于定殖研究。

2.3 內(nèi)生菌B69菌株在人參植株內(nèi)及其根際土壤中的定殖動態(tài)

2.3.1 內(nèi)生菌B69菌株在根際土壤中的定殖動態(tài) 由圖5可知，B69菌株具有較好的土壤定殖能力。隨著時間的延長，其在自然土和滅菌土中定殖量的消長動態(tài)一致，均呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢。B69菌株在滅菌土中的定殖量小于在自然土中的定殖量，在滅菌土中的定殖量變化幅度則大于在自然土中的定殖量變化幅度。分析其原因可能是因為土壤滅菌后其理化性質(zhì)、土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)遭到破壞，且沒有其他微生物對所接入生防細菌的影響，從而可能相對不利于生防細菌定殖能力的發(fā)揮。B69菌株在土壤中定殖的初始菌量為1×107 CFU/g，第3天后在滅菌土和自然土中定殖量迅速下降，第10天定殖量達到1個峰值，在自然土和滅菌土中分別為6.57×106、4.25×106 CFU/g;第10天以后隨著處理時間的延長定殖量逐漸減少，但在第30天B69菌株在自然土和滅菌土中的定殖量仍可達到105 CFU/g以上。

2.3.2 內(nèi)生菌B69菌株在人參植株內(nèi)的定殖動態(tài) 人參定苗的進行標記菌株發(fā)酵液灌根，第3天開始定期檢測標記菌株在人參根、莖、葉中的定殖數(shù)量，發(fā)現(xiàn)植株的根中可檢測到菌株，但對照中無。從定殖數(shù)量上看，B69菌株在人參植株的根內(nèi)定殖數(shù)量最大，莖中次之，葉中最少（圖6，圖7）;隨著定殖時間的延長，各部分定殖菌量呈現(xiàn)先增后減的趨勢，這說明細菌進入植物體內(nèi)的途徑可能與根部有關(guān)。B69菌株在人參體內(nèi)表現(xiàn)出一定的定殖能力，從不同處理來看，自然土中菌株在人參體內(nèi)的傳導(dǎo)能力優(yōu)于滅菌土，且自然土中的定殖菌量高于滅菌土，因此推斷自然土中存在的某些微生物可能有利于B69菌株的定殖。自然土中生防菌株B69在人參根、莖、葉內(nèi)的最大定殖量均出現(xiàn)在第15天，分別為3.54×106、5.26×105、2.12×105 CFU/g;滅菌土中生防菌株B69在人參根、莖、葉內(nèi)的最大定殖量也出現(xiàn)在第15天，分別為2.11×106、

2.62×105、5.83×104 CFU/g。

2.4 內(nèi)生菌B69發(fā)酵液對人參根腐病的盆栽防效

由表1可以看出，內(nèi)生菌B69菌株發(fā)酵液對根腐病的防治效果明顯。采用保護作用處理的防效優(yōu)于治療作用處理的防效，兩者的防效分別達到60.8%、56.6%，表明菌株B69發(fā)酵液的預(yù)防作用效果較好，但兩者防效差異不顯著。保護作用處理和治療作用處理的病情指數(shù)分別為25.32、28.11，均低于對照處理的47.83，差異達到顯著水平（P<0.05）。

2.5 內(nèi)生菌B69對人參根腐病的田間防效

由表2可以看出，在不接種病原菌的CK中，根腐病發(fā)病的病情指數(shù)為41.58，CK組的病情指數(shù)可達單接根腐病病菌組的67%左右。結(jié)果表明，5年生人參苗本身已經(jīng)存在發(fā)病機制，若不接種根腐病病菌，供試人參苗亦可發(fā)病。在單接根腐病病菌對照中，病情指數(shù)為61.34;在內(nèi)生菌B69菌株與根腐病病菌混接處理中，病情指數(shù)為25.41，其對根腐病的相對防效為58.56%;而在10%多菌靈可濕性粉劑與根腐病病菌混接處理中，病情指數(shù)為28.14，其對根腐病的相對防效為54.12%?？梢姡谰鶥69菌株對人參根腐病具有更好的防治效果，且其相對防效顯著高于農(nóng)藥處理組（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

研究表明，定殖是生防菌發(fā)揮作用的重要因素，許多室內(nèi)防治效果顯著的菌株在田間很難達到預(yù)期的效果，究其原因是不能有效定殖于植物根際或體內(nèi)[13]。本研究采用抗生素標記法，篩選出最佳標記菌株。定殖動態(tài)結(jié)果表明，B69菌株在人參根際可有效定殖30 d以上，覆蓋人參的整個旺盛生長期，表明B69菌株在生產(chǎn)實踐上具有較大的生物防治潛力。

細菌作為生防菌防治植物病害主要是利用其強力的競爭機制，其中芽孢桿屬（Bacillus spp.）由于具有抗逆性強、繁殖速度快、易于培養(yǎng)等優(yōu)點而被廣泛用作生防菌源[14]。Dionisio利用B. amyloliquefaciens DGA14防治香蕉的冠腐病取得了較好的效果[15];Chen等利用B. amyloliquefaciens S20控制茄子的細菌性枯萎病效果顯著[16];賈斌等利用解淀粉芽孢桿菌拮抗人參黑斑病病菌，抑制率達到80%[17]。本研究結(jié)果表明，死谷芽孢桿菌B69菌株對根腐病病菌抑制效果明顯。盆栽試驗結(jié)果表明，采用保護作用處理的防效優(yōu)于治療作用處理的防效，兩者的防效分別達到60.8%、56.6%，表明B69菌株發(fā)酵液的預(yù)防作用效果較好。保護和治療作用處理的病情指數(shù)分別為25.32、28.11，均顯著低于對照組的47.83（P<0.05）。田間試驗結(jié)果表明，人參在栽植后單接根腐病病菌的病情指數(shù)為61.34;在生防菌與根腐病病菌混接處理中，人參在栽植后的病情指數(shù)為25.41，其對人參根腐病的相對防效為 58.56%;而在10%多菌靈可濕性粉劑與根腐病病菌混接處理中，人參在栽植后的病情指數(shù)為28.14，其對人參根腐病的相對防效為 54.12%，可見，B69菌株對人參根腐病具有更好的防治效果，且其相對防效較農(nóng)藥組高4.44%。因此驗證了B69菌株是防治根腐病的良好菌源，具有較大的開發(fā)潛能。

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