呂峰 嚴(yán)興洪 王小紅 嚴(yán)林俊 張敏 陸德祥

摘要：以條斑紫菜優(yōu)良品系深豐1號(hào)、深豐2號(hào)及野生品系WT為試驗(yàn)對(duì)象，在條斑紫菜自由絲狀體移植育苗過(guò)程中設(shè)置不同的自由絲狀體移植量和光溫條件，研究不同生態(tài)條件下條斑紫菜不同品系絲狀體生長(zhǎng)和殼孢子放散量情況。結(jié)果表明，貝殼絲狀體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，10～50 μmol/（m2·s）范圍內(nèi)提高光密度或15～25 ℃范圍內(nèi)提高溫度都能加快貝殼絲狀體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，初始藻落密度提高，絲狀體能更快布滿貝殼表面，獲得更高的藻落密度;條斑紫菜貝殼絲狀體培養(yǎng)適宜的移植量、光密度、培養(yǎng)溫度分別為100 mg/m2、10 μmol/（m2·s）、20 ℃。

關(guān)鍵詞：條斑紫菜;優(yōu)良品系;自由絲狀體;移植;貝殼;殼孢子放散量

中圖分類號(hào)： S917.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0186-02

目前，我國(guó)大規(guī)模養(yǎng)殖的紫菜種類主要為壇紫菜（Porphyra haitanensis Chang et Zheng）和條斑紫菜（Porphyra yezoensis Ueda），其中，壇紫菜是我國(guó)特有的品種，其產(chǎn)量約占全國(guó)紫菜產(chǎn)量的75%[1]，主要在福建、浙江等南方省份廣泛養(yǎng)殖，而條斑紫菜則主要在江蘇、山東等2個(gè)省份養(yǎng)殖。傳統(tǒng)的貝殼絲狀體育苗是將成熟葉狀體放散的果孢子播撒到貝殼表面，使其鉆入貝殼形成貝殼絲狀體，成熟的貝殼絲狀體釋放出殼孢子，并附網(wǎng)萌發(fā)長(zhǎng)成紫菜葉狀體苗。傳統(tǒng)的育苗方法設(shè)施簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)易，生產(chǎn)技術(shù)已基本穩(wěn)定成熟，易于擴(kuò)大規(guī)模推廣，至今仍在世界各國(guó)廣泛應(yīng)用[2]。但是，有研究發(fā)現(xiàn)，紫菜果孢子也可以不鉆入貝殼，在海水中可以直接萌發(fā)成自由生活的絲狀體，而利用大量繁殖的自由絲狀體并培養(yǎng)至殼孢子放散可直接采苗以養(yǎng)成紫菜。目前，各國(guó)藻類學(xué)者對(duì)不同紫菜品種自由絲狀體發(fā)育過(guò)程中主要影響因子和發(fā)育調(diào)控機(jī)制等進(jìn)行了大量研究，以實(shí)現(xiàn)對(duì)紫菜自由絲狀體發(fā)育的精確調(diào)控，并完善相應(yīng)的自由絲狀體直接采苗技術(shù)，但迄今仍局限于實(shí)驗(yàn)室研究或小規(guī)模生產(chǎn)性試驗(yàn)，尚未達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)育苗應(yīng)用的水平[2-4]。

深豐1號(hào)、深豐2號(hào)是人工誘變培育出的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗高溫條斑紫菜品系，具有耐高溫、生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等特性，其大規(guī)模養(yǎng)殖可使條斑紫菜的產(chǎn)量和品質(zhì)有大幅度提升。本試驗(yàn)以深豐1號(hào)、深豐2號(hào)為材料，研究不同移植量、移植期不同光溫條件對(duì)貝殼絲狀體生長(zhǎng)量和殼孢子放散量的影響，以期探索出條斑紫菜優(yōu)良品系自由絲狀體適宜的移植密度和光溫條件，并完善自由絲狀體移植和培養(yǎng)技術(shù)，為條斑紫菜優(yōu)良品系自由絲狀體大規(guī)模移植育苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

條斑紫菜品系深豐1號(hào)、深豐2號(hào)，由南通科技職業(yè)學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院通過(guò)人工誘變選育獲得，并以自由絲狀體保存;條斑紫菜野生型品系WT，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室2001年從江蘇省啟東市呂四港鎮(zhèn)海區(qū)采摘，其分離與保存參照文獻(xiàn)[5]中的方法進(jìn)行。絲狀體移植使用的貝殼為文蛤殼，經(jīng)洗刷和水煮處理，放入長(zhǎng)、寬、高分別為20.5、14.0、5.0 cm的長(zhǎng)方形塑料盒中，15個(gè)貝殼1組。培養(yǎng)液由自然海水加2-（N-嗎啉）乙磺酸緩沖液（MES緩沖液）[6]配制而成。

1.2 貝殼絲狀體促熟

試驗(yàn)于2016年4月至2017年8月在上海海洋大學(xué)藻類育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，貝殼絲狀體培養(yǎng)至移植后50 d，將貝殼絲狀體移至溫度為23 ℃、光密度為30 μmol/（m2·s）（8 h光照/16 h黑暗）條件下培養(yǎng)，每7 d更換1次添加1 mg/mL氮、10 mg/mL 磷的滅菌海水，以促進(jìn)貝殼絲狀體的成熟;培養(yǎng)至移植后85 d，將絲狀體已成熟的單個(gè)貝殼置于200 mL燒杯中，加入50 mL培養(yǎng)液進(jìn)行沖氣培養(yǎng)3～4 d，溫度降至（18±1） ℃，以促使殼孢子放散。

1.3 殼孢子放散量計(jì)數(shù)

當(dāng)每個(gè)視野（10×10）有10個(gè)殼孢子左右時(shí)，開(kāi)始統(tǒng)計(jì)殼孢子的放散量。將50 mL殼孢子水倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，沉淀24 h，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)40個(gè)視野（10×10）內(nèi)的殼孢子數(shù);取單個(gè)視野內(nèi)殼孢子數(shù)平均值，根據(jù)1個(gè)視野的面積和培養(yǎng)皿底面積，計(jì)算出1個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)的殼孢子數(shù)，即為該貝殼的殼孢子日放散量;連續(xù)計(jì)數(shù)3 d，其總和即為貝殼的總殼孢子放散量。對(duì)每組15個(gè)貝殼全部計(jì)數(shù)，取平均值，即為該組單個(gè)貝殼的殼孢子放散量。

1.4 不同試驗(yàn)條件對(duì)貝殼絲狀體生長(zhǎng)量和殼孢子放散量的影響

1.4.1 移植量 貝殼絲狀體移植量分別為50、100、200、350、500 mg/m2，統(tǒng)計(jì)初始藻落密度后轉(zhuǎn)移至溫度為18 ℃、光密度為10 μmol/（m2·s）（14 h光照/10 h黑暗）條件下培養(yǎng)，每7 d更換1次培養(yǎng)液，并分別于移植后25、35、45 d拍攝貝殼絲狀體生長(zhǎng)狀況照片;貝殼絲狀體促熟，并統(tǒng)計(jì)殼孢子放散量。

1.4.2 光密度 貝殼絲狀體移植量為100 mg/m2，培養(yǎng)至 14 d，洗去貝殼表面多余的自由絲狀體，分別置于光密度為10、30、50 μmol/（m2·s）（14 h光照/10 h黑暗）條件下培養(yǎng)，溫度為 18 ℃，每7 d更換1次培養(yǎng)液，并于移植后25、35、45 d 拍照;貝殼絲狀體促熟，并統(tǒng)計(jì)殼孢子放散量。

1.4.3 溫度 貝殼絲狀體移植量為100 mg/m2，培養(yǎng)至 14 d，洗去貝殼表面多余的自由絲狀體，分別置于溫度為15、20、25 ℃條件下培養(yǎng)，光密度為10 μmol/（m2·s）（16 h光照/10 h黑暗），每7 d更換1次培養(yǎng)液，并于移植后25、35、45 d 拍照;貝殼絲狀體促熟，并統(tǒng)計(jì)殼孢子放散量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同移植量對(duì)貝殼絲狀體生長(zhǎng)和殼孢子放散量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著初始藻落密度的提高，貝殼絲狀體能更快布滿貝殼表面，在相同時(shí)間內(nèi)形成更密的藻絲層。由圖1可知，隨移植量的增加，深豐1號(hào)、深豐2號(hào)、WT這3個(gè)品系的殼孢子放散量均呈先增后減的趨勢(shì)，以移植量為 100 mg/m2 時(shí)殼孢子放散量相對(duì)最多;對(duì)不同移植量而言，除深豐2號(hào)在貝殼絲狀體移植量為200 mg/m2時(shí)殼孢子放散量相對(duì)最多外，其他移植量均以WT的殼孢子放散量相對(duì)最多。

2.2 不同光密度對(duì)貝殼絲狀體生長(zhǎng)和殼孢子放散量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著光密度增加，貝殼絲狀體生長(zhǎng)明顯加快，與低光密度下培養(yǎng)的貝殼絲狀體相比，貝殼絲狀體在較高的光密度下能更快布滿貝殼表面，藻落密度相對(duì)更大。由圖2 可知，當(dāng)移植量為100 mg/m2、光密度在10～50 μmol/（m2·s） 范圍內(nèi)時(shí)，隨著光密度增加，各貝殼絲狀體殼孢子放散量呈降低趨勢(shì);在不同光密度條件下，WT的殼孢子放散量相對(duì)最多。

2.3 不同溫度對(duì)貝殼絲狀體生長(zhǎng)和殼孢子放散量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度提高能明顯加快貝殼絲狀體的生長(zhǎng)，在較高溫度條件下，貝殼絲狀體能更快布滿貝殼表面，藻落密度大于低溫條件下培養(yǎng)的貝殼絲狀體。由圖3可知，當(dāng)移植量為100 mg/m2、培養(yǎng)溫度在15～25 ℃范圍內(nèi)時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，各貝殼絲狀體殼孢子放散量呈先增后減的趨勢(shì)，20 ℃時(shí)貝殼絲狀體殼孢子的放散量相對(duì)最多;培養(yǎng)溫度為15、25 ℃條件下，WT的殼孢子放散量相對(duì)最多。

3 結(jié)論與討論

在生產(chǎn)上應(yīng)用自由絲狀體技術(shù)，既可縮短絲狀體的培養(yǎng)周期，又可有效控制絲狀體在貝殼上的密度而得到健全的殼孢子，減少絲狀體培育過(guò)程中病害的發(fā)生[7]。目前，自由絲狀體技術(shù)作為條斑紫菜育種、選種的重要手段在日本得到廣泛應(yīng)用。馬家海等研究認(rèn)為，利用條斑紫菜自由絲狀體進(jìn)行移植育苗，適宜的移植密度非常重要[7]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，貝殼絲狀體移植量在50～500 mg/m2范圍內(nèi)，提高自由絲狀體移植量可以大幅度增加鉆入貝殼的初始藻落密度，增加貝殼內(nèi)的絲狀體生物量，但是，當(dāng)移植量超過(guò)100 mg/m2，貝殼絲狀體放散的殼孢子量反而減少，其原因可能是當(dāng)貝殼內(nèi)初始藻落密度超過(guò)一定限度，雖然貝殼內(nèi)藻絲大量生長(zhǎng)，但藻絲間相互過(guò)分重疊，導(dǎo)致中下層的藻絲對(duì)光照、營(yíng)養(yǎng)的需求得不到滿足，從而影響膨大藻絲的形成或膨大藻絲細(xì)胞無(wú)法同步發(fā)育成熟，影響了殼孢子的集中放散。因此，自由絲狀體移植育苗時(shí)，合適的移植量對(duì)培育合理密度的貝殼絲狀體、促進(jìn)殼孢子集中大量放散有重要影響，過(guò)高、過(guò)低的移植量均會(huì)降低貝殼絲狀體殼孢子的放散量。

紫菜絲狀體的光補(bǔ)償點(diǎn)很低，貝殼絲狀體在自然環(huán)境低光密度條件下能生存，在更深的海底也有分布[8]，但是，光密度低于10 μmol/（m2·s）時(shí)，貝殼絲狀體生長(zhǎng)過(guò)于緩慢，而直射光超過(guò)60 μmol/（m2·s）可引起絲狀體死亡。本試驗(yàn)結(jié)果表明，10～50 μmol/（m2·s）光密度條件下培養(yǎng)的貝殼絲狀體能正常生長(zhǎng)，并放散殼孢子，且提高光密度對(duì)貝殼絲狀體生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用;當(dāng)光密度為10 μmol/（m2·s）時(shí)，深豐1號(hào)、深豐2號(hào)、WT這3個(gè)品系的殼孢子放散量相對(duì)最多，隨著光密度的增加，貝殼絲狀體殼孢子放散量逐漸下降。因此，在10～50 μmol/（m2·s） 范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整光密度，是調(diào)控貝殼絲狀體生長(zhǎng)以獲得適當(dāng)貝殼絲狀體密度的有效方法。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度在15～25 ℃時(shí)，貝殼絲狀體的生長(zhǎng)隨溫度的升高而明顯加快，但20 ℃時(shí)貝殼絲狀體殼孢子的放散量卻相對(duì)最多，這是由于15 ℃時(shí)貝殼絲狀體生長(zhǎng)較為緩慢，在相同培養(yǎng)時(shí)間條件下，導(dǎo)致獲得的貝殼絲狀體密度過(guò)低，總量相對(duì)較少，造成殼孢子放散量相對(duì)較少，而25 ℃時(shí)貝殼絲狀體生長(zhǎng)過(guò)快，藻絲過(guò)于密集，貝殼絲狀體不能同步成熟，殼孢子也不能大量集中放散。因此，20 ℃是培養(yǎng)貝殼絲狀體較為適宜的溫度。

參考文獻(xiàn)：

[1]嚴(yán)興洪，李 琳，有賀祐勝. 壇紫菜減數(shù)分裂位置的雜交試驗(yàn)分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2006，30（1）：1-7.

[2]何培民，秦 松，嚴(yán)小軍，等. 海藻生物技術(shù)及其應(yīng)用[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：99-105.

[3]王素平，姜紅如. 條斑紫菜游離絲狀體生態(tài)的研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，1983（5）：1-5.

[4]湯曉榮，費(fèi)修綆. 光溫與壇紫菜自由絲狀體生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系[J]. 海洋與湖沼，1997，28（5）：475-482.

[5]Kato M，Aruga Y. Comparative studies on the growth and photosynthesis of the pigmentation mutants of Porphyra yezoensis in laboratory culture[J]. Japan Journal of Phyco1ogy，1984，32：334-347.

[6]王素娟，張小平，徐志東，等. 壇紫菜營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究Ⅰ[J]. 海洋與湖沼，1986，17（3）：217-221，271-272.

[7]馬家海，蔡守清. 條斑紫菜的栽培與加工[M]. 北京：科學(xué)出版社，1996：77-84.

[8]陳昌生，紀(jì)德華，王秋紅，等. 壇紫菜絲狀體種質(zhì)保存技術(shù)的研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005，29（6）：745-750.