毛啟新，孫亞冬，張崇建，劉山青，李永，申衍，李連方

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科，鄭州4500080

中國乳腺癌的發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重影響患者的健康。免疫微環(huán)境對于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要的影響，其中髓系抑制性細(xì)胞（myeloidderived suppressor cell，MDSC）因其免疫抑制作用、固有性影響和適應(yīng)性免疫反應(yīng)引起較大關(guān)注，報道較多[1-2]。作為重要的全身治療方法之一，內(nèi)分泌治療在雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性和（或）孕激素受體（progesterone receptor，PR）陽性乳腺癌患者術(shù)后輔助治療、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療和術(shù)前新輔助治療中發(fā)揮重要的作用[3-4]。既往文獻(xiàn)報道，無論是選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬，還是芳香化酶抑制劑來曲唑，均可影響腫瘤微環(huán)境中的特定免疫成分[5-6]，但對于MDSC的作用尚缺乏報道。因此，本研究分析了乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物對MDSC的影響，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年8月至2016年8月于鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受術(shù)后輔助治療的53例乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診為乳腺癌；②接受過乳腺癌改良根治手術(shù)或保乳手術(shù)治療；③術(shù)后均接受過蒽環(huán)序貫紫杉類藥物化療；④術(shù)后病理免疫組織化學(xué)檢測ER和（或）PR陽性，需接受內(nèi)分泌治療；⑤對本研究知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者不能配合研究。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入53例患者，均為女性；年齡為42～82歲，平均年齡為（57.28±10.48）歲；腫瘤直徑為1.29～9.04 cm，平均腫瘤直徑為（4.52±1.59）cm；陽性腋窩淋巴結(jié)數(shù)量為1～6枚，平均數(shù)量為（3.25±1.27）枚。采用簡單隨機(jī)化分組法將53例患者隨機(jī)分為他莫昔芬組（他莫昔芬治療）22例和來曲唑組（來曲唑治療）31例。他莫昔芬組患者的平均年齡為（59.86±11.85）歲；平均腫瘤直徑為（4.56±1.89）cm；平均陽性腋窩淋巴結(jié)數(shù)量為（3.50±1.26）枚；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌15例，浸潤性小葉癌5例，其他2例；臨床分期：0～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期6例。來曲唑組患者的平均年齡為（55.45±9.15）歲；平均腫瘤直徑為（4.49±1.37）cm；平均陽性腋窩淋巴結(jié)數(shù)量為（3.06±1.26）枚；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌22例，浸潤性小葉癌7例，其他2例；臨床分期：0～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期8例。兩組患者的平均年齡、平均腫瘤直徑、平均陽性腋窩淋巴結(jié)數(shù)量、病理類型、臨床分期比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)備案。

1.2 治療方法

根據(jù)中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2017年版）[7]，對ER和（或）PR陽性的患者應(yīng)用內(nèi)分泌藥物進(jìn)行治療，藥物包括他莫昔芬（10 mg，口服，每天2次）和來曲唑（2.5 mg，口服，每天1次）。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測及分選MDSC

抽取入組患者內(nèi)分泌治療前外周血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，確定基線數(shù)據(jù)；內(nèi)分泌治療6個月后，再次檢測外周血MDSC，從而明確他莫昔芬和來曲唑?qū)θ橄侔┗颊進(jìn)DSC數(shù)量和功能的影響。應(yīng)用氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞，離心后移除上層清液，使用Hanks液重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整濃度至2×107/ml。將50 μl細(xì)胞懸液與熒光抗體混勻，暗室低溫孵育30 min，Hanks液游離抗體后上機(jī)檢測或分選。檢測或分選MDSC所用流式熒光抗體均購于美國BD公司，包括APC-CD33、Pacific blue-CD45和Per-CP-CY5.5-HLA-DR。

1.4 MDSC功能鑒定

應(yīng)用體外培養(yǎng)體系分析MDSC對T細(xì)胞增殖的影響。常溫環(huán)境中，應(yīng)用羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（carboxfluorescencein diacetate succinimidyl ester，CFSE）標(biāo)記外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），反應(yīng)10 min后Hanks液洗滌。已標(biāo)記的PBMC接受植物凝集素（phytohemagglutinin，PHA）刺激，單獨培養(yǎng)或與分選獲得的MDSC共培養(yǎng)72 h。未加MDSC即為陽性對照。培養(yǎng)結(jié)束后，依據(jù)CFSE熒光強(qiáng)度判斷T細(xì)胞的增殖程度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血MDSC相對數(shù)、絕對數(shù)比較

內(nèi)分泌治療前，他莫昔芬組與來曲唑組患者的MDSC相對數(shù)、絕對數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療6個月后，他莫昔芬組與來曲唑組患者的MDSC相對數(shù)、絕對數(shù)均明顯低于本組治療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.623、18.883，P＜0.01；t=14.614、14.496，P＜0.01）；治療6個月后，來曲唑組患者的MDSC相對數(shù)、絕對數(shù)均明顯低于他莫昔芬組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.477、3.539，P＜0.01）。（表1）

表1 兩組患者內(nèi)分泌治療前及治療 6個月后外周血MDSC的相對數(shù)、絕對數(shù)（± s）

表1 兩組患者內(nèi)分泌治療前及治療 6個月后外周血MDSC的相對數(shù)、絕對數(shù)（± s）

images/BZ_80_1292_1754_2246_1799.png相對數(shù)（%）絕對數(shù)（×106/ml）治療前治療6個月后治療前治療6個月后14.95±5.20 9.65±3.50 7.59±3.34 2.92±1.18 14.77±6.36 3.09±1.91 8.89±3.10 1.73±0.35）

2.2 T細(xì)胞增殖水平比較

他莫昔芬組與來曲唑組患者的外周血經(jīng)MDSC處理后的CD3+T細(xì)胞的增殖水平分別為（30.25±4.94）%和（65.93±17.48）%，均明顯低于本組未加MDSC的（73.98±10.58）%和（76.48±10.65）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=36.376、8.600，P＜0.01）；來曲唑組患者的外周血經(jīng)MDSC處理后的CD3+T細(xì)胞的增殖水平明顯高于他莫昔芬組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=18.694，P＜0.01）；兩組未加MDSC的CD3+T細(xì)胞的增殖水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

在世界范圍內(nèi)，乳腺癌已成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。作為乳腺癌全身治療的重要方法之一，內(nèi)分泌治療從20世紀(jì)70年代起用于臨床腫瘤治療，現(xiàn)階段可用于乳腺癌術(shù)后輔助治療、術(shù)前新輔助治療及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療。主要治療藥物包括他莫昔芬和芳香化酶抑制劑（阿那曲唑、來曲唑及依西美坦等），目前主要依據(jù)患者的月經(jīng)情況選擇藥物。內(nèi)分泌治療可明顯延長ER和（或）PR陽性乳腺癌患者的生存期并提高生活質(zhì)量，但相當(dāng)比例的患者仍出現(xiàn)疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響預(yù)后。在此過程中，自身免疫抑制發(fā)揮了重要作用，涉及多種固有性和獲得性免疫系統(tǒng)組成成分[8-10]。本研究重點探討常用的內(nèi)分泌治療藥物對于具有免疫調(diào)節(jié)功能的MDSC的影響，結(jié)果提示他莫昔芬和來曲唑均可減少乳腺癌患者外周血MDSC的相對數(shù)及絕對數(shù)，并抑制其免疫抑制功能；兩組比較，來曲唑作用更為顯著。

腫瘤免疫微環(huán)境不僅包含效應(yīng)性成分，抑制惡性腫瘤細(xì)胞局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，還包含調(diào)節(jié)性成分，抑制效應(yīng)性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致疾病進(jìn)展[11]。此類研究既往主要圍繞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行，而近年來MDSC成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的另一研究熱點。MDSC為一類異質(zhì)性髓系細(xì)胞亞群，由各階段前體細(xì)胞和祖細(xì)胞共同構(gòu)成[12]。粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等成熟髓系細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化形成，多種病理過程均可抑制髓系細(xì)胞正常分化，導(dǎo)致造血干細(xì)胞異常分化，從而產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)功能的MDSC[13]。小鼠中，MDSC表達(dá)細(xì)胞表面分子CD11b和Gr1；而人體內(nèi)MDSC缺乏特異性鑒定標(biāo)志物，通常定義為同時表達(dá)CD11b和CD33的髓系細(xì)胞，同時不表達(dá)或低表達(dá)HLA-DR[14]。MDSC對多種免疫細(xì)胞有抑制作用，其中對T細(xì)胞的影響最為顯著，可明顯降低其增殖水平和分泌功能。MDSC參與腫瘤微環(huán)境的形成與維持，有助于乳腺癌細(xì)胞的免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Miky?ková等[15]發(fā)現(xiàn)，MDSC 水平與外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，晚期乳腺癌患者外周血MDSC水平明顯高于早期患者，且MDSC與患者生存時間呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示MDSC水平及功能與腫瘤負(fù)荷有關(guān)，可作為新型生物標(biāo)志物預(yù)測患者的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險和評估預(yù)后。

對于藥物與乳腺癌MDSC的相互作用，國內(nèi)外均有文獻(xiàn)報道。Kusmartsev等[14]利用荷瘤小鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸通過直接抗腫瘤作用和抑制集落刺激因子釋放的間接機(jī)制影響MDSC的分化和腫瘤內(nèi)蓄積。Miky?ková等[15]檢測環(huán)磷酰胺處理后的MDSC的免疫抑制功能，結(jié)果顯示MDSC的免疫抑制功能顯著提高，提示環(huán)磷酰胺對MDSC具有誘導(dǎo)作用。在荷瘤小鼠模型中應(yīng)用舒尼替尼可明顯減少脾臟MDSC數(shù)目，有助于免疫重塑[16]。雷帕霉素對MDSC的誘導(dǎo)[16]和抑制[17]作用均有文獻(xiàn)支持，尚無統(tǒng)一結(jié)論。由此可見，不同藥物對MDSC的影響差異較大，且非人體試驗數(shù)據(jù)，無法指導(dǎo)臨床用藥。本研究進(jìn)行臨床觀察性試驗，在國內(nèi)尚屬首次，具有較大學(xué)術(shù)創(chuàng)新意義和臨床推廣價值。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物他莫昔芬和來曲唑均可抑制MDSC的擴(kuò)增和激活，減少MDSC數(shù)量及抑制其功能。上述兩種藥物已成為最為常見的乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物，之前研究主要從殺傷腫瘤細(xì)胞的能力和降低不良反應(yīng)的發(fā)生率方面比較不同藥物的優(yōu)劣，為臨床決策提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。本研究結(jié)果顯示，相對于他莫昔芬，來曲唑具有更顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，以及抑制MDSC聚集及其功能的作用，重塑免疫微環(huán)境可能對于腫瘤的控制具有積極的意義，最終延長患者生存期，提高生活質(zhì)量。圍繞他莫昔芬和來曲唑等藥物對MDSC的調(diào)節(jié)機(jī)制，結(jié)合上述文獻(xiàn)，提出假設(shè)，內(nèi)分泌治療藥物可能會直接抑制MDSC擴(kuò)增及激活，或通過相關(guān)細(xì)胞因子間接作用，誘導(dǎo)MDSC內(nèi)自噬和凋亡水平升高。在接下來的工作中，計劃借助離體細(xì)胞或整體動物模型對此加以研究和分析。綜上所述，對于乳腺癌術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療患者，他莫昔芬和來曲唑均可明顯減少患者外周血MDSC的數(shù)量，并降低其功能，而兩者相比，來曲唑的作用更為顯著。這將拓展對乳腺癌腫瘤微環(huán)境的理解，并為治療藥物的精準(zhǔn)選擇提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。