王少青，張玉萍，許楓，黃春雷，代先慧#青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 青島66000

2青島市腫瘤醫(yī)院放療科，山東 青島2660000

肺癌作為威脅人類生命健康的常見惡性腫瘤之一，在男性和女性腫瘤中的發(fā)病率分別居第1位和第3位[1]，肺癌的病死率在全球范圍內(nèi)腫瘤中居第1位，尤其在中國，肺癌的病死率呈逐年升高趨勢。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，放化療等治療能夠改善肺癌患者的生存情況，但是患者的5年生存率仍未超過20%[2]。肺癌的發(fā)生是由多種因素綜合作用的，其中腫瘤細(xì)胞增殖在其中發(fā)揮重要作用[3]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者傾向于從分子生物學(xué)機(jī)制中探索肺癌的發(fā)生及發(fā)展過程，從而改善肺癌患者的生活質(zhì)量，提高患者的遠(yuǎn)期生存率[4-5]。相關(guān)研究表明，肝癌衍生生長因子（hepatoma-derived growth factor，HDGF）與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]；NET-1是四聚體超家族成員之一，主要參與細(xì)胞的黏附、增殖及分化等，與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[7]；組蛋白去乙?；?（histone deacetylases 1，HDAC1）是哺乳動(dòng)物的第1個(gè)組蛋白去乙?；福诮M蛋白乙?；降恼{(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[8]。本文探討了肺癌患者肺癌組織中HDGF、NET-1和HDAC1的表達(dá)水平及其與肺癌患者臨床特征的關(guān)系，旨在為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2016年12月青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院收治的肺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診，并經(jīng)過計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）及B超輔助診斷；②接受根治性手術(shù)治療；③病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肺、腎等重大臟器病變者；②精神、意識(shí)障礙者；③處于特殊時(shí)期，如妊娠期或哺乳期；④術(shù)前接受放化療者；⑤術(shù)后生存時(shí)間小于3個(gè)月者。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共選取肺癌患者126例。其中，男82例，女44例；年齡30～76歲，平均（59.62±3.27）歲；≥60歲68例，＜60歲58例；有吸煙史59例，無吸煙史67例；病理分型：腺癌43例，鱗癌55例，小細(xì)胞癌28例；分化程度：高中分化51例，低分化75例；TNM分期：Ⅰ期45例，Ⅱ期29例，Ⅲ期28例，Ⅵ期24例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移62例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移64例；有血管浸潤41例，無血管浸潤85例。收集肺癌患者的肺癌組織標(biāo)本和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（距腫瘤組織2 cm以上）標(biāo)本各126例。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人HDGF多克隆抗體、兔抗人NET-1多克隆抗體及兔抗人HDAC1多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（streptavidin-perosidase，SP）免疫組織化學(xué)染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DMI6000B型Leica全自動(dòng)顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

取肺癌組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本，置于4%的甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水后使用石蠟進(jìn)行包埋和切片，采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色。首先，將石蠟標(biāo)本切成4 μm的連續(xù)切片，并平鋪在3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷處理過的載玻片上，于60℃烤箱中加熱4 h，進(jìn)行常規(guī)脫蠟，滴加30 ml 3%雙氧水孵育10 min，從而消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；使用蒸餾水漂洗樣本，置于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，加熱修復(fù)抗原；在標(biāo)本中加入5%的正常山羊血清，在37℃下封閉10 min，然后滴加HDGF多克隆抗體（1∶12 500）、NET-1多克隆抗體（1∶20）和HDAC1多克隆抗體（1∶100），37℃條件下，在濕盒中孵育1 h，接著使用PBS漂洗；使用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶孵育10 min，PBS漂洗10 min。使用色源底物溶液孵育10 min，再用蒸餾水漂洗；使用DAB顯色，再用蘇木精復(fù)染，最后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明和封片。

1.4 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)[2,7-8]

比較肺癌組織和癌旁組織中HDGF、NET-1和HDAC1的表達(dá)水平，并對(duì)HDGF、NET-1、HDAC1表達(dá)水平與肺癌患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行分析；分析肺癌組織中HDGF、NET-1、HDAC1表達(dá)與肺癌患者TNM分型、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的相關(guān)性，以及肺癌患者肺癌組織中HDGF、NET-1、HDAC1表達(dá)的相關(guān)性。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定：HDGF以細(xì)胞核呈棕黃色或黃色顆粒分布為陽性表達(dá)，NET-1以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈棕黃色或黃色顆粒分布為陽性表達(dá)，HDAC1以細(xì)胞核呈棕黃色或黃色顆粒分布為陽性表達(dá)。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選擇每個(gè)切片中的10個(gè)不重復(fù)視野進(jìn)行閱片。采用半定量計(jì)分法計(jì)算腫瘤細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例。染色強(qiáng)度：1分，淡黃色；2分，黃色；3分，棕黃色。陽性細(xì)胞所占比例：0分，≤5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，≥76%。以兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：0分，為陰性（-）；1～4分，為弱陽性（+）；5～8分，為中等陽性（++）；9～12分，為強(qiáng)陽性（+++）。本研究以（+）～（+++）作為陽性表達(dá)，（-）作為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；采用Spearman等級(jí)分析進(jìn)行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HDGF、NET- 1和HDAC 1陽性表達(dá)率的比較

肺癌組織中HDGF、NET-1和HDAC1的陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中HDGF、NET- 1和HDAC 1陽性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 肺癌組織中HDGF、NET- 1和HDAC 1的陽性表達(dá)情況與肺癌患者臨床特征的關(guān)系

吸煙、分化程度為高中分化、TNM分期為Ⅲ～Ⅵ期、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移肺癌患者肺癌組織中HDGF、NET-1、HDAC1的陽性表達(dá)率均明顯高于未吸煙、分化程度為低分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移肺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2HDGF=8.740、17.117、7.660、19.967，PHDGF＜0.01；χ2NET-1=12.286、16.846、14.681、14.975，PNET-1＜0.01；χ2HDAC1=6.909、15.856、20.181、17.362，PHDAC1＜0.01）。不同性別、年齡、病理分型、血管浸潤情況肺癌患者肺癌組織中HDGF、NET-1和HDAC1的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征肺癌患者肺癌組織中HDGF、NET- 1和HDAC 1的陽性表達(dá)情況

2.3 肺癌組織中HDGF、NET- 1和HDAC 1的陽性表達(dá)率與肺癌發(fā)展的相關(guān)性分析

Spearman等級(jí)分析結(jié)果顯示：肺癌組織中HDGF的陽性表達(dá)率與肺癌患者的TNM分期、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況均呈正相關(guān)（r=0.708、0.689、0.719，P＜0.05）；肺癌組織中NET-1的陽性表達(dá)率與肺癌患者的TNM分期、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況均呈正相關(guān)（r=0.717、0.705、0.698，P＜0.05）；肺癌組織中HDAC1的陽性表達(dá)率與肺癌患者的TNM分期、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況均呈正相關(guān)（r=0.702、0.721、0.729，P＜0.05）。

2.4 肺癌組織中HDGF、NET- 1和HDAC 1陽性表達(dá)率的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：肺癌組織中HDGF的陽性表達(dá)率與NET-1和HDAC1的陽性表達(dá)率呈正相關(guān)（r=0.698、0.727，P＜0.05）；肺癌組織中NET-1的陽性表達(dá)率與HDAC1的陽性表達(dá)率呈正相關(guān)（r=0.709，P=0.033）。

3 討論

癌基因和抑癌基因表達(dá)水平異常時(shí)，可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄基因異常表達(dá)，使細(xì)胞的分化和增殖過程發(fā)生異常，細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常使得細(xì)胞增殖周期發(fā)生變化，甚至凋亡程序消失[9]。HDGF最初是由Nakamura在1994年從HuH7肺癌細(xì)胞系培養(yǎng)液中分離出來的肽類物質(zhì)，HDGF在多種類型腫瘤中的表達(dá)水平異常升高，如肺癌、食管癌、胰腺癌等，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[10]。HDGF由240個(gè)氨基酸殘基組成，包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，定位于1q21-q23，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，通過PWWP結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合發(fā)揮功能轉(zhuǎn)錄因子的功能[2]。隨著對(duì)HDGF的深入研究，發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于正常組織和腫瘤組織中，在細(xì)胞增殖、血管生成、胚胎發(fā)育及細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，而且HDGF的表達(dá)具有時(shí)相性，主要在器官發(fā)育早期表達(dá)，細(xì)胞分化程度越高，其表達(dá)水平越高，HDGF既可以在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，又可以在細(xì)胞核中表達(dá)[11]。四聚體超家族含有4個(gè)疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，構(gòu)成細(xì)胞外兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氨基和羧基位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，各分子間的序列高度保守，并且跨膜區(qū)域內(nèi)包括大部分的同源序列，NET-1作為4個(gè)跨膜區(qū)域蛋白超家族成員之一，是一種腫瘤增殖相關(guān)蛋白，定位于1p34.1，mRNA全長為1297 bp，開放閱讀框包括241個(gè)氨基酸，參與細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞的黏附、增殖、分化過程，NET-1在惡性腫瘤的表達(dá)水平異常升高，如肝癌、肺癌、腎癌、胰腺癌等[12]。組蛋白的修飾過程包括乙酰化、磷酸化和甲基化，乙?；怯绊懟蜣D(zhuǎn)錄的重要機(jī)制，而組蛋白的乙?；^程受HDAC的調(diào)節(jié)[8]，組蛋白的乙酰化和去乙?；瘜?duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用，HDAC共有4種類型，主要通過修飾組蛋白調(diào)節(jié)基因或轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，HDAC1屬于Ⅰ型HDAC，是第1個(gè)與哺乳動(dòng)物相關(guān)的組蛋白去乙?；?，包括482個(gè)氨基酸[7,13]。

本研究對(duì)肺癌組織與癌旁正常組織中HDGF、NET-1和HDAC1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中HDGF、NET-1、HDAC1的陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01），提示HDGF、NET-1和HDAC1可能作為診斷肺癌的有效生物學(xué)指標(biāo)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，不同吸煙史、分化程度、TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況肺癌患者肺癌組織中HDGF、NET-1、HDAC1的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并且HDGF、NET-1、HDAC1的陽性表達(dá)率均與肺癌患者的TNM分期、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)（P＜0.05），表明HDGF、NET-1和HDAC1與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。HDGF能夠通過加速胚胎細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的增殖和生長速度，提高內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的遷移速度，促進(jìn)新血管生成[14]。NET-1與細(xì)胞黏附因子協(xié)同作用影響?zhàn)じ揭蕾囆韵掠涡盘?hào)，激活酪氨酸激酶的磷酸化，加速細(xì)胞的分裂，同時(shí)減緩細(xì)胞凋亡速度[15]。HDAC1與多種影響細(xì)胞分化、增殖的轉(zhuǎn)錄因子直接作用，敲除HDAC1的細(xì)胞增殖活性下降，凋亡過程減慢，是由于HDAC1影響分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)完整性和功能性，最終影響肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡過程[16]。另外HDAC1調(diào)控周期蛋白依賴性激酶的表達(dá)水平，同時(shí)使腫瘤細(xì)胞的增殖活動(dòng)停止在G1期，阻滯腫瘤細(xì)胞的凋亡，干擾肺癌細(xì)胞中下調(diào)信號(hào)相關(guān)蛋白ErbB2的表達(dá)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1的活性，并且降低端粒酶活性[17]。吸煙導(dǎo)致肺癌的發(fā)生，主要是因?yàn)槲鼰熯^程中煙草產(chǎn)生大量的致癌或促癌物質(zhì)，導(dǎo)致肺癌的發(fā)生及發(fā)展，從而提高相關(guān)蛋白的表達(dá)水平[5]。本研究對(duì)上述3種指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌組織中HDGF、NET-1和HDAC1的陽性表達(dá)率間均呈正相關(guān)（P＜0.05），推測主要是由于上述3種指標(biāo)通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成過程而相互影響。

綜上所述，肺癌組織中HDGF、NET-1和HDAC1的陽性表達(dá)率異常升高，并且與肺癌的發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)應(yīng)戒煙以預(yù)防或減緩肺癌進(jìn)展，HDGF、NET-1和HDAC1 3種分子生物學(xué)指標(biāo)的臨床意義重大，值得臨床推廣應(yīng)用。