李好 周武碧

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類(lèi)通過(guò)特殊的環(huán)形拼接形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的RNA，相較于微小RNA（miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），circRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有更高的穩(wěn)定性和序列保守性。circRNA可以與miRNA結(jié)合充當(dāng)“miRNA海綿”，也可以在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而間接調(diào)控蛋白表達(dá)[1-4]。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道circRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[5-10]。有學(xué)者通過(guò)微陣列分析，首次發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0016788在肝癌組織中高表達(dá)，且能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[11]。目前關(guān)于hsa_circ_0016788在結(jié)直腸癌中的作用尚未完全清楚，故本研究探討了結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中hsa_circ_0016788的表達(dá)差異，同時(shí)分析結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響，并采用體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hsa_circ_0016788與結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料及細(xì)胞系來(lái)源 cDNA組織芯片（包含80例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本和15例癌旁正常組織標(biāo)本）購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司，包含了完整的臨床資料（如年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期等）及隨訪資料，患者手術(shù)時(shí)間為2006年2月至2010年2月，隨訪至2015年9月，隨訪期間病死44例，所有患者術(shù)前未予放化療。4株結(jié)直腸癌細(xì)胞（HT-29、HCT116、SW480、LOVO）和 1株正常腸上皮細(xì)胞（HCO）購(gòu)自上海中科院生物化學(xué)研究所，所有細(xì)胞在10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.2 hsa_circ_0016788表達(dá)水平檢測(cè) 使用Trizol試劑提取結(jié)直腸癌細(xì)胞及正常腸上皮細(xì)胞RNA，使用2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；抽提質(zhì)檢cDNA組織芯片腫瘤組織和癌旁正常組織RNA后（由上海芯超生物科技有限公司完成），鋪于96孔板上。使用RT-PCR試劑和ABI 7500 PCR儀器檢測(cè)細(xì)胞株和cDNA組織芯片中hsa_circ_0016788表達(dá)水平。以甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，測(cè)得的hsa_circ_0016788與GAPDH的閾值循環(huán)數(shù)（Ct）之差為 ΔCt，使用 2-ΔΔCt計(jì)算 circRNA的相對(duì)表達(dá)量；以上實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)3次，取平均值。引物序列：GAPDH正向5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，反向 5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′；hsa_circ_0016788 正 向 5′-CAGTTTATGATTGCCGTCCTCC-3′，反向 5′-GTGATCGTCTAGGTGGTAACC-3′。取80例結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)，＜中位數(shù)則定義為hsa_circ_0016788低表達(dá)，≥中位數(shù)則定義為hsa_circ_0016788高表達(dá)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 3條hsa_circ_0016788的siRNA由上海吉?jiǎng)P基因有限公司合成。將5×105個(gè)細(xì)胞鋪在6孔板中，經(jīng)過(guò)24h，細(xì)胞密度達(dá)70%～80%。使用lipo2000轉(zhuǎn)染siRNA或陰性對(duì)照序列，孵育48h后收集細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測(cè)RNA敲減效率。siRNA寡核苷酸序列：si_circ_0016788-1#5′-CTTCAGGCACAGGTAGGTCT-3′，si_circ_0016788-2#5′-CTACTTCAGGCAGTCTTCC-3′，si_circ_0016788-3#5′-AGGCACAGGTCTTCCCAAGGG-3′。

1.4 細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后狀態(tài)良好的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞，使用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml，將細(xì)胞懸液以200μl/孔加入Transwell上室（侵襲實(shí)驗(yàn)需要事前鋪一層膠在小室中），加入600μl培養(yǎng)液在下層小室；孵育24h，使用棉花球?qū)⑸蠈游赐ㄟ^(guò)小孔的細(xì)胞擦去，而通過(guò)小孔的細(xì)胞作甲醛固定、結(jié)晶紫染色，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。繪制Kaplan-Meier曲線，hsa_circ_0016788高、低表達(dá)者生存率比較采用log-rank法。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中hsa_circ_0016788表達(dá)的比較 結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788相對(duì)表達(dá)量為4.26±0.15，明顯高于癌旁正常組織的1.59±0.16（P＜0.05）。

2.2 結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788表達(dá)與患者N分期、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），與患者年齡、性別、T分期等均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 hsa_circ_0016788對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 對(duì)4株結(jié)直腸癌細(xì)胞（HT-29、HCT116、SW480、LOVO）和1株正常腸上皮細(xì)胞（HCO）中hsa_circ_0016788表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株結(jié)直腸癌細(xì)胞中hsa_circ_0016788 相對(duì)表達(dá)量（4.17±0.20、3.47±0.25、3.20±0.20、1.83±0.25）均明顯高于正常腸上皮細(xì)胞（1.00±0.23），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖1a。選取HCT116轉(zhuǎn)染3個(gè)siRNA敲減circ_0016788，siRNA 1#效果明顯，hsa_circ_0016788表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖 1b。選擇siRNA 1#進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，敲減hsa_circ_0016788后，HCT116細(xì)胞的遷移、侵襲能力均明顯下降（均P＜0.05），見(jiàn)圖 2（插頁(yè)）。

圖1 結(jié)直腸癌細(xì)胞中hsa_circ_0016788相對(duì)表達(dá)量比較（a：4株結(jié)直腸癌細(xì)胞及1株正常腸上皮細(xì)胞中hsa_circ_0016788相對(duì)表達(dá)量比較；b：HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-circ_0016788后hsa_circ_0016788相對(duì)表達(dá)量比較）

圖2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)敲減hsa_circ_0016788后對(duì)HCT116細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響（a、c：HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-circ_0016788后遷移能力明顯下降；b、d：HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-circ_0016788后侵襲能力明顯下降；結(jié)晶紫染色，×100）

2.4 結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 經(jīng)生存分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788高表達(dá)的患者總體生存率低于低表達(dá)者（P＜0.05），見(jiàn)圖3a。對(duì)Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌患者分別進(jìn)行生存分析，均為hsa_circ_0016788高表達(dá)患者生存率低于低表達(dá)者（均P＜0.05），見(jiàn)圖3b-c。經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788高表達(dá)是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（RR=22.712，P＜0.05），見(jiàn)表 2。

圖3 結(jié)直腸癌患者h(yuǎn)sa_circ_0016788高、低表達(dá)者的Kaplan-Meier生存曲線（a：80例結(jié)直腸癌患者；b：39例Ⅱ期結(jié)直腸癌患者；c：36例Ⅲ期結(jié)直腸癌患者）

表2 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，這表明hsa_circ_0016788可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生，其高表達(dá)可能促使結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖或突變，從而形成腫瘤。腫瘤細(xì)胞一般先侵襲局部基底膜或微血管轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，再通過(guò)淋巴循環(huán)或血循環(huán)形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此腫瘤是否具有侵襲性、有無(wú)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)判斷預(yù)后十分重要[12-15]。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0016788表達(dá)與N分期（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）有關(guān)；體外遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hsa_circ_0016788能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，提示hsa_circ_0016788可能具有促使結(jié)直腸癌患者發(fā)生腫瘤局部侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用。Zhang等[16]報(bào)道了由hsa_circ_0016788翻譯而來(lái)的三維序列包含蛋白11，通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，EMT過(guò)程在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中廣泛存在，該過(guò)程將上皮細(xì)胞重新編程，使其具有間充質(zhì)表型，更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[17]。因此，筆者推測(cè)hsa_circ_0016788也可能通過(guò)EMT過(guò)程來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移，但是需要后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。既往研究表明，hsa_circ_0016788具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的功能[11]；但本研究未發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0016788與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0016788高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者總體生存率明顯低于低表達(dá)者，結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0016788高表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，hsa_circ_0016788可能促進(jìn)了結(jié)直腸癌的遷移和侵襲，后期仍需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證；同時(shí)其高表達(dá)提示結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。