張建燁，管 勇，孔 峰，趙升田

山東大學(xué)第二醫(yī)院 1泌尿外科 2中心實驗室，濟南 2500333山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院泌尿外科，濟南 250012

慢性腎臟病所引起的終末期腎病已成為導(dǎo)致全球人口死亡的一個重要因素[1]，其主要治療措施包括透析和腎臟移植。由于長期透析會產(chǎn)生多種嚴重并發(fā)癥，如心血管疾病、感染和骨病等，給患者及其家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔[2]，因此腎臟移植是目前最為理想的替代治療方式。然而，腎源的短缺及腎臟移植后需要終身服用抗免疫排斥藥物嚴重限制了其廣泛應(yīng)用[3- 4]，利用干細胞進行再生醫(yī)學(xué)的研究則為終末期腎病的治療帶來希望，其中，腎臟脫細胞支架結(jié)合干細胞的研究引起了廣泛關(guān)注。 2013年，Song等[5]首次采用脫細胞腎臟支架結(jié)合內(nèi)皮細胞和上皮細胞共培養(yǎng)并進行原位移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植腎臟能夠產(chǎn)生尿液，這是腎臟再生研究中一個里程碑式的進步。目前更多學(xué)者更加傾向于應(yīng)用腎臟脫細胞支架結(jié)合干細胞進行腎臟再生研究，因為干細胞可多向分化，具有良好的可塑性，在特定條件下能分化為特定的細胞類型，因此，干細胞的引入使采用腎臟脫細胞支架實現(xiàn)腎臟再生的研究向前邁進了一步。哺乳動物腎臟的產(chǎn)生來源于間介中胚層，間介中胚層又分化為后腎間質(zhì)、輸尿管芽，之后分別分化為腎單位和集合管，故間介中胚層被認為是腎臟發(fā)生的初始階段。脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSC)具有分化的多向性，便于從患者自身組織獲取，容易培養(yǎng)并且具有成瘤性低的特點，目前研究已證實中胚層來源的脂肪干細胞可以向多個方向分化，并且可以跨越胚層向其他胚層分化[6- 7]。本研究擬通過誘導(dǎo)ADSC分化為間介中胚層樣細胞，然后與腎臟脫細胞支架共培養(yǎng)，以期構(gòu)建有部分腎臟結(jié)構(gòu)的組織工程腎臟，為慢性腎病的治療提供選擇。

材料和方法

材料健康雄性Wistar大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量約250 g，由山東大學(xué)動物實驗中心提供；動物維護遵循全國營養(yǎng)學(xué)會和醫(yī)學(xué)會的指導(dǎo)原則，并經(jīng)山東大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會備案和審批[批準號：KYLL- 2017 (GJ)A- 0011]。ADSC完全培養(yǎng)基(ADSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗+1%谷氨酰胺)(美國Cyagen公司)、ADSC成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(成骨分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+0.1 μmol/L地塞米松+50 μmol/L抗壞血酸+10 mmol/L β-磷酸甘油)(美國Cyagen公司)、ADSC成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(成脂分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1 μmol/L地塞米松+10 μmol/L胰島素+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L甲基黃嘌呤)(美國Cyagen公司)、ADSC成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(成軟骨分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+10 μg/L TGF-β3+0.1 μmol/L地塞米松+50 μmol/L維生素C+6.25 mg/L胰島素)(美國Cyagen公司)；糖原合成酶激酶3抑制劑(CHIR99021)(美國R&D公司)、成纖維生長因子9(fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9)(美國R&D公司)、抗CD34流式抗體(美國Thermo公司)、抗CD45流式抗體(美國Thermo公司)、抗CD90 流式抗體(美國Thermo公司)、抗CD105流式抗體(美國Thermo公司)、抗鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(odd-skipped related 1，OSR1)抗體(英國Abcam公司)、抗配對盒基因- 2(paired-box 2，PAX2)抗體(英國Abcam公司)、抗E-鈣黏素(E-Cadherin，E-CAD)抗體(英國Abcam公司)、抗GATA結(jié)合蛋白- 3(GATA-binding protein，GATA3)抗體(英國Abcam公司)、抗Wilms腫瘤基因1(Wilms’tumor 1，WT1)抗體(英國Abcam公司)。WB電泳儀(美國伯樂公司)、WB轉(zhuǎn)膜儀(美國伯樂公司)、WB顯影儀(美國ProteinSimple公司)、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

ADSC獲取采用10%水合氯醛麻醉Wistar大鼠，斜行剪開腹股溝區(qū)皮膚，剪取1塊脂肪墊，使用PBS清洗，并置于培養(yǎng)皿中加入等體積的0.1%的Ⅰ型膠原酶，37 ℃旋轉(zhuǎn)消化1 h，至變?yōu)榘咨槊訝?，棄去沒有被消化的組織，將消化物置于離心機中1500 r/min(r=13 cm)離心10 min后棄去上清，用脂肪間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基重懸底部細胞團，接種到培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每2 d更換培養(yǎng)基去除未貼壁的細胞和組織，每天在光鏡下觀察待細胞密度達培養(yǎng)瓶80%后進行消化傳代，獲得ADSC。

ADSC的成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)及鑒定待ADSC細胞密度接近80%時更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3 d換液，21 d后進行茜素紅染色，觀察分化情況。同樣方法采用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)ADSC，每3 d換液，誘導(dǎo)14 d后進行油紅O染色，觀察分化情況。采用成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)ADSC，每3 d換液，誘導(dǎo)21 d后進行阿利新藍染色，觀察成軟骨誘導(dǎo)情況。

ADSC流式鑒定采用0.25%胰酶消化ADSC細胞，待大部分細胞懸浮后以等量體積的培養(yǎng)基中和胰酶，將混合液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管內(nèi)1200 r/min(r=13 cm)離心5 min后棄上清液，加入PBS洗2次后將細胞分為6組，濃度均調(diào)整至1×106/ml，終體積為100 μl，按照說明中稀釋比例每組中分別加入CD34、CD45、CD90、CD105流式抗體，并采用相同來源的免疫蛋白作為陰性對照。避光孵育30 min后再用PBS洗2次以洗除未結(jié)合抗體，重懸細胞上機檢測。

間介中胚層樣細胞的誘導(dǎo)待ADSC在培養(yǎng)皿中密度接近50%時開始誘導(dǎo)，實驗采用Takasato誘導(dǎo)人多能干細胞(induce pluripotent stem cells，iPSC)向間介中胚層分化的誘導(dǎo)方案開啟誘導(dǎo)[8- 9]，于第0天、第2天加入8 μmol/L CHIR99021，于第4天、第6天加入200 ng/ml的FGF9進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)至第7天后收獲間介中胚層樣細胞，置于鏡下觀察細胞形態(tài)。

間介中胚層樣細胞的免疫熒光鑒定將誘導(dǎo)7 d的ADSC細胞爬片棄去培養(yǎng)基，使用PBS沖洗3次后加入細胞固定液固定30 min，用PBS洗凈，加入Triton X- 100通透30 min，而后使用5%山羊血清封閉液封閉1 h，洗凈封閉液后分別加入OSR1和PAX2兩種間介中胚層特異性表面標志物抗體4 ℃孵育過夜，第2天用PBS沖洗后加入一抗所對應(yīng)的熒光二抗，室溫孵育1 h后加入DAPI進行核染，5 min后洗凈多余DAPI進行封片處理，置于熒光顯微鏡下觀察，同時以未誘導(dǎo)ADSC作為對照進行染色觀察。

間介中胚層樣細胞的Western blot鑒定將誘導(dǎo)7 d后的ADSC消化后加入蛋白裂解液。每個樣品取10 μg 行 SDS-PAGE 凝膠電泳實驗，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(OSR1和PAX2) 4 ℃孵育過夜，次日采用HRP標記的二抗室溫孵育 1 h后用化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

腎臟脫細胞支架的獲取將Wistar大鼠取腹部正中切口，結(jié)扎腎動脈分支以上的腹主動脈后，離斷腎動脈、腎靜脈和輸尿管獲取腎臟，并在腎動脈和輸尿管插套管針，用蠕動泵以500 μl/min流速由動脈端灌注0.5%SDS進行脫細胞處理，6 h后腎臟變?yōu)橥该鳂樱僖酝瑯恿魉俟嘧o菌PBS以沖洗SDS和細胞碎片。

腎臟脫細胞支架的再細胞化將誘導(dǎo)得到的間介中胚層樣細胞通過支架動脈端和輸尿管端注入，同脫細胞支架進行共培養(yǎng)，置于自制腎臟體外培養(yǎng)系統(tǒng)進行循環(huán)灌注，保持37 ℃恒溫，并持續(xù)通氣進行培養(yǎng)，10 d后獲得再細胞化的腎臟。

再細胞化的脫細胞腎臟支架鑒定對結(jié)合間介中胚層樣細胞的腎臟脫細胞支架進行HE染色。將組織進行包埋、切片，并給予脫蠟和復(fù)水處理。其后依次進行蘇木素和伊紅染色，伊紅染色結(jié)束后再逆梯度酒精進行脫水，最后進行封片處理，置于顯微鏡下觀察，腎臟脫細胞支架HE染色方法同上。對再細胞化支架進行免疫熒光鑒定，鑒定腎臟的足細胞標志物WT1和腎小管標志物GATA3及E-CAD的表達情況。

結(jié) 果

ADSC的鑒定傳至第4代的ADSC在光鏡下呈長梭形(圖1A)，成骨誘導(dǎo)21 d后可見骨化結(jié)節(jié)形成(圖1B)，成脂誘導(dǎo)14 d后可見圓形脂滴形成(圖1C)，成軟骨誘導(dǎo)21 d后可見軟骨球形成(圖1D)。流式鑒定結(jié)果顯示，細胞表面標志物中CD90和CD105表達陽性，陽性率分別為98.7%和98.3%；CD34和CD45表達陰性，陽性率分別為2.5%和1.9%，以相同來源的免疫蛋白作為陰性對照進行染色，陽性率為1.1%(圖1E)。

將ADSC向間介中胚層樣細胞誘導(dǎo)后的形態(tài)觀察利用體外培養(yǎng)不同時間點添加不同生長因子將ADSC向間介中胚層樣細胞誘導(dǎo)7 d，可以觀察到獲得的間介中胚層樣細胞形態(tài)較ADSC形態(tài)產(chǎn)生明顯變化，細胞由長梭形逐漸變?yōu)楸馄綐拥亩噙呅?圖2)。

間介中胚層樣細胞的熒光鑒定將脂肪間充質(zhì)干細胞向間介中胚層樣細胞誘導(dǎo)，7 d后對細胞進行OSR1和PAX2兩個間介中胚層特異性表面標志物的鑒定，結(jié)果顯示可以觀察到陽性表達，以ADSC做陰性對照，可以觀察到上述兩個標志物在ADSC中不表達(圖3)。

ADSC：脂肪干細胞

ADSC：adipose-derived stem cells

A. ADSC光鏡下形態(tài)；B.經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的茜素紅染色；C.成脂誘導(dǎo)后的油紅O染色；D.成軟骨誘導(dǎo)后的阿利新藍染色；E.流式檢測ADSC標志物，CD90和CD105陽性率分別為98.7%和98.3%，CD34和CD45陽性率分別為2.5%和1.9%，相同來源的免疫蛋白作為陰性對照陽性率為1.1%(以上實驗獨立重復(fù)3次以上)

A.microscopic observation of ADSCs；B.alizarin red staining of ADSCs after osteogenic differentiation；C.oil red O staining of ADSCs after adipogenic differentiation；D.alcian blue staining of ADSCs after chondrogenic differentiation；E.surface marker analysis by flow cytometry：CD90 and CD105 were 98.7% and 98.3% and CD34 and CD45 were 2.5% and 1.9%，respectively

圖1ADSC的成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)及流式鑒定

Fig1Induction of ADSCs adipogenic，osteogenic，chondrogenic differentiation and identification of ADSCs by flow cytometry

IM：間介中胚層

IM：intermediate mesoderm

A.ADSC誘導(dǎo)為間介中胚層樣細胞分化前的細胞形態(tài)呈長梭形；B.誘導(dǎo)間介中胚層樣細胞分化7 d后的細胞形態(tài)為扁平樣多邊形(以上實驗獨立重復(fù)3次以上)

A. ADSCs were spindle-shaped under microscope before induction；B. after induction of ADSCs into IM-like cells for 7 days，the cells became flat and polygonous (all these experiments repeated three times)

圖2誘導(dǎo)脂肪干細胞分化為間介中胚層樣細胞

Fig2Induction of ADSCs differentiate into IM-like cells

OSR1：鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子；PAX2：配對盒基因- 2；DAPI：4’，6-二脒基- 2-苯基吲哚

OSR1：odd-skipped related 1；PAX2：paired-bax 2；DAPI：4’，6-diamidino- 2-phenylindole

A.將誘導(dǎo)后獲得的IM樣細胞進行OSR1染色，可以觀察到陽性表達，未誘導(dǎo)的ADSC為陰性表達；B.將IM樣細胞進行PAX2染色，觀察到陽性表達，未誘導(dǎo)ADSC為陰性表達(以上實驗獨立重復(fù)3次以上)

A. after induction of ADSC into IM-like cells，immunofluorescence of OSR1 showed positive results，with non-induced ADSCs as negative control；B. after induction of ADSCs into IM-like cells，immunofluorescence of PAX2 showed positive results，with non-induced ADSC as negative control (all these experiments repeated three times)

圖3IM樣細胞的鑒定

Fig3Identification of IM-like cells

間介中胚層樣細胞的Western檢測將誘導(dǎo)7 d所獲得的間介中胚層樣細胞進行Western blot驗證，結(jié)果顯示，以小鼠9.5 d胚胎軀干尾部位置的組織作為陽性對照，可以觀察到誘導(dǎo)7 d后OSR1和PAX2的陽性表達，而誘導(dǎo)前的ADSC并沒有觀察到類似現(xiàn)象(圖4)。

獲取腎臟脫細胞支架取出大鼠腎臟，于腎動脈和輸尿管插入套管針，由腎動脈灌注0.5%SDS，6 h后腎臟變?yōu)闊o色透明樣，對取得的腎臟和腎臟脫細胞支架進行HE染色，可以觀察到腎臟脫細胞支架中已無細胞結(jié)構(gòu)，并且保留了正常腎臟的整體結(jié)構(gòu)(圖5)。

間介中胚層樣細胞在脫細胞支架中的生長情況將間介中胚層樣細胞從腎臟脫細胞支架的動脈端和輸尿管端注入，結(jié)合支架共培養(yǎng)10 d后進行組織切片，通過HE染色可以觀察到細胞在支架內(nèi)均勻分布于腎小球，腎小管等部位(圖6)。

間介中胚層樣細胞在支架中的分化情況鑒定對再細胞化的支架進行免疫熒光鑒定，可以觀察到E-CAD、GATA3和WT1的陽性表達(圖7)。

圖4Western blot檢測誘導(dǎo)前后OSR1和PAX2的表達情況，可以觀察到誘導(dǎo)7 d后的細胞有陽性表達，而未誘導(dǎo)的細胞無此現(xiàn)象，以小鼠胚胎9.5 d組織作為陽性對照(以上實驗獨立重復(fù)3次以上)

Fig4Western blot for the detection of the expressions of PAX2 and OSR1 in ADSCs and IM-like cells，with mouse embryos at day 9.5(E9.5) a positive control；PAX2 and OSR1 were not expressed in ADSCs but were highly expressed in E9.5 and IM-like cells induced from ADSCs (all these experiments repeated three times)

A.在大鼠腎臟腎動脈和輸尿管插入留置針；B.經(jīng)過6 h SDS灌注沖洗后大鼠腎臟由紅色變?yōu)闊o色透明樣；C.HE染色觀察大鼠腎臟結(jié)構(gòu)；D.HE染色觀察腎臟脫細胞支架的結(jié)構(gòu)，未見細胞成分(以上實驗獨立重復(fù)3次以上)

A.harvesting of kidney with arterial and ureteral cannulae；B. after 6 h of perfusion with SDS，the kidney became transparent；C.HE staining of normal kidney；D.HE staining of decllularized scaffold(all these experiments repeated three times)

圖5脫細胞支架的制備與鑒定

Fig5Decellularization and identification of rat kidney scaffolds

A.細胞分布整體情況；B.腎小球內(nèi)的細胞分布；C.腎小管內(nèi)的細胞分布情況

A.HE staining shows the gross appearance；B.cell distribution in the glomerulus region；C. cell distribution in in tubules

圖6間介中胚層樣細胞對脫細胞支架進行再細胞化

Fig6Recellularization of kidney scaffolds with IM-like cells

討 論

在終末期腎病的治療中，目前所采用的透析和腎臟移植并不能有效解決患者的疾病，透析可嚴重影響患者的生活質(zhì)量，并產(chǎn)生心血管疾病及骨病等并發(fā)癥[10]；腎臟移植受供體短缺的限制而不能廣泛應(yīng)用，且患者需終身服用抗免疫排斥藥物，給患者、家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔[11]。腎臟再生研究的發(fā)展為慢性腎臟病、終末期腎病的治療提供了一種新的策略。由于腎臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包括至少26種細胞[12]，所以需要一種整體腎臟再生的方法。腎臟脫細胞支架具有正常腎臟結(jié)構(gòu)，保留了細胞外因子，將脫細胞支架結(jié)合干細胞，可利用支架的微環(huán)境和細胞外基質(zhì)所保留因子的作用誘導(dǎo)干細胞定向分化，產(chǎn)生腎臟結(jié)構(gòu)，通過體內(nèi)移植實現(xiàn)有結(jié)構(gòu)和有功能的再生腎臟。

ADSC具有多向分化潛能并且成瘤性較低。經(jīng)ADSC誘導(dǎo)的間介中胚層樣細胞比胚胎干細胞和iPSC誘導(dǎo)所得細胞更加穩(wěn)定。與其他干細胞相比，ADSC具有來源豐富、易培養(yǎng)、無免疫排斥、增殖速度快、能夠跨胚層多向分化等優(yōu)點。ADSC由中胚層分化而來，在特定的生長因子和環(huán)境誘導(dǎo)下可以向不同的細胞系分化，已經(jīng)確認可以經(jīng)過誘導(dǎo)成骨[13]、成脂[7]和成軟骨分化[6]，也可以分化為內(nèi)胚層來源的肝細胞[14]、胰島β樣細胞[15]及外胚層來源的神經(jīng)細胞[16]、心肌細胞[17]和上皮細胞[18]等。本研究則成功地在體外環(huán)境下將ADSC誘導(dǎo)分化為間介中胚層樣細胞。因體外誘導(dǎo)獲得的細胞未能完全模擬體內(nèi)發(fā)育的間介中胚層而得到全部腎臟細胞類型，為將其與體內(nèi)發(fā)育產(chǎn)生的間介中胚層細胞加以區(qū)分，本研究將體外誘導(dǎo)的細胞命名為間介中胚層樣細胞，表示可以表達間介中胚層細胞的表面標志物OSR1和PAX2，并能經(jīng)過誘導(dǎo)進一步分化為腎系細胞類型，但不能完全實現(xiàn)體內(nèi)發(fā)育階段的間介中胚層生物特性的一類細胞。

E-CAD：E-鈣黏素；GATA3：GATA結(jié)合蛋白- 3；WT1：Wilms腫瘤基因- 1

E-CAD：E-cadherin；GATA3：GATA binding protein- 3；WT1：Wilms’tumor- 1

A.腎小管區(qū)域可見E-CAD陽性表達；B. 足細胞區(qū)域可見WT1陽性表達；C.腎小管區(qū)域可見GATA3陽性表達；D.GATA3與E-CAD共染；E.GATA3與WT1共染(以上實驗獨立重復(fù)3次以上)

A. expression of E-CAD in tubules；B. expression of WT1 in podocytes region；C. expression of GATA3 in tubules；D. expressions of GATA3 and E-CAD；E. expressions of GATA3 and WT1 (all these experiments repeated three times)

圖7免疫熒光鑒定再細胞化腎臟

Fig7Identification of recellularized kidney by immunofluorescence

本研究對誘導(dǎo)所得的間介中胚層樣細胞進行鑒定，進一步確定所誘導(dǎo)的細胞能夠表達間介中胚層細胞標志物，隨后將其作為種子細胞結(jié)合腎臟脫細胞支架用于腎臟再生研究。將間介中胚層樣細胞和支架共培養(yǎng)10 d后可以觀察到細胞黏附現(xiàn)象，免疫熒光鑒定可以發(fā)現(xiàn)間介中胚層樣細胞結(jié)合支架可以產(chǎn)生腎小管樣和足細胞樣的分化，證明經(jīng)過誘導(dǎo)的干細胞結(jié)合脫細胞支架后可以進一步分化，而在先前的研究中直接利用干細胞結(jié)合支架并不能觀察到分化的情況，可見脫細胞支架具有誘導(dǎo)處于特定細胞階段的干細胞分化的能力，可作為一種理想的生物材料用于腎臟再生研究。

以往研究顯示，將干細胞結(jié)合脫細胞支架進行共培養(yǎng)后可以觀察到干細胞在支架中貼附，但不能產(chǎn)生腎臟祖細胞或表達腎臟特有的標志物[19]。本研究則可觀察到腎小管和足細胞標志物的表達，這是實現(xiàn)腎臟再生研究向前邁進的一步。目前，基于腎臟再生的研究主要集中在以下5種技術(shù)的應(yīng)用：脫細胞支架[20]、囊胚互補[21]、后腎移植[22]、腎臟類器官[8]和生物人工腎[23]。其中，腎臟脫細胞支架結(jié)合干細胞是一種較為理想的腎臟再生方式。研究表明，腎臟脫細胞支架保持了原先腎臟的正常三維結(jié)構(gòu)，并且支架內(nèi)的細胞因子在脫細胞前后沒有明顯變化，這些細胞因子的存在使干細胞在支架內(nèi)能夠定向分化[24]。但有研究顯示，單純的未經(jīng)誘導(dǎo)的干細胞在支架作用下并不能展現(xiàn)出良好的分化能力[25]，考慮可能由于干細胞的分化方向多樣，僅僅依靠支架內(nèi)細胞因子的含量不足以使單純未經(jīng)誘導(dǎo)的干細胞定性分化為某種特定的成體細胞。此外，不同分化階段的干細胞結(jié)合支架產(chǎn)生進一步分化所涉及的信號通路可能不同，未誘導(dǎo)干細胞結(jié)合支架所涉及的信號通路可能與干細胞自身分化的信號通路產(chǎn)生沖突，因而在支架內(nèi)的干細胞不能展現(xiàn)出良好的定向分化能力。因此，本研究將干細胞首先誘導(dǎo)至間介中胚層樣細胞階段，再通過脫細胞支架的作用誘導(dǎo)間介中胚層樣細胞向腎系分化，結(jié)果也證實了該思路的可行性。

總之，國內(nèi)外研究所面臨的問題是干細胞的貼附及分化效率不夠令人滿意，并且尚不能起到替代完整腎臟功能的作用，這也是我們今后研究的重點。一旦脫細胞支架技術(shù)能夠成功，將會為終末期腎病的治療提供新的選擇。