陳江波，徐國帥，蔡相軍，劉洪濤，孫凱麗，羅 雪

1中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平分院普通外科，沈陽 1100032中國醫(yī)科大學研究生院，沈陽 1101223中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平分院病理科，沈陽 110003

胃癌是全球范圍內(nèi)最主要的致死性癌癥之一，2012年中國胃癌的死亡病例達到32.5萬例[1]。中國胃腸腫瘤外科聯(lián)盟的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2014～2016年在外科就診的胃癌患者中，早期胃癌所占比例僅為19.5%[2]，而胃癌的早期診斷與治療是改善其預后的關(guān)鍵因素。近年研究表明，分析胃癌相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物的變化對了解胃癌的生物學行為有重要意義。胃動蛋白1(gastrokine- 1，GKN1)是一種胃腸黏膜特異性表達蛋白，能夠抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)并下調(diào)Wnt信號通路中β-catenin和cyclin D1的表達，發(fā)揮抑癌效應[3]。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的異常活化與腫瘤(包括胃癌)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。 Y染色體性別決定基因相關(guān)的高速泳動蛋白家族9(Sry-related high mobility group box 9，SOX9)蛋白既是Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)因子，也是其下游靶蛋白，作為轉(zhuǎn)錄因子，它與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[4- 5]，但在胃癌中的作用尚不明確且存在爭議。SOX9和GKN1都與β-catenin密切聯(lián)系，而兩者在胃癌中表達的相關(guān)性及預后情況在國內(nèi)外少有報道，本研究探討了SOX9和GKN1在胃癌中的表達及其與患者臨床病理因素和預后的關(guān)系，旨在為胃癌發(fā)病機制的探索及其診斷和治療提供新的方向和思路。

對象和方法

對象2012年1月至2013年5月于中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平分院收治并手術(shù)治療的70例胃癌患者，收集所有患者的臨床資料并根據(jù)病例號選取相應的病理蠟塊(包括胃癌和癌旁組織)。納入標準：(1)術(shù)前未行放化療及靶向藥物治療；(2)腫瘤為原發(fā)病灶且術(shù)前、術(shù)中均未發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移；(3)術(shù)式為D1或D2胃癌根治術(shù)，受檢淋巴結(jié)≥15個；(4)術(shù)后標本均經(jīng)病理證實為腺癌，病理資料完整；(5)癌旁組織距離腫瘤邊緣≥5 cm。70例胃癌患者中，男52例，女18例；平均年齡(61.7±10.2)歲(32～82歲)，平均腫瘤大小為(4.3±2.5)cm(0.5～11.0 cm)。腫瘤分期參照2010年由美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)發(fā)布的第7版TNM分期標準[6]，因納入的胃癌患者均無遠處轉(zhuǎn)移，故本研究無Ⅳ期病例。70例癌旁胃黏膜組織中，27例為腸化生組織，43例為正常胃黏膜組織。本研究獲中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平分院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

免疫組織化學染色采用免疫組織化學SP法對70例胃癌標本和相應癌旁組織進行染色，具體為：石蠟標本經(jīng)4 μm連續(xù)切片，脫蠟、水化，pH6.0檸檬酸鹽修復液中高壓抗原修復；3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性后用正常山羊血清封閉組織中的非特異性結(jié)合位點；滴加一抗SOX9(1∶ 400)或GKN1(1∶ 400)，4℃孵育過夜。復溫并洗滌后滴加二抗和HPR標記的鏈霉卵白素；DAB顯色5 min；自來水沖洗后用蘇木紫復染、分化、返藍；脫水、透明、中性樹脂封片。選擇已知的陽性切片作為陽性對照，以PBS溶液(pH=7.3)代替一抗作陰性對照。染色結(jié)果由2名副高以上的病理科醫(yī)師采用雙盲法進行判定，按細胞著色程度評分：(1)無著色，0分；(2)淺黃色，1分；(3)棕黃色，2分；(4)棕褐色，3分。每張切片按白細胞計數(shù)法隨機連續(xù)選擇 10個高倍視野(10×40)，各計數(shù)100個細胞，按陽性細胞比例的平均值評分：(1)<5%，0分；(2)6%～25%，1分；(3)26%～50%，2分；(4)51%～75%，3分；(5)>75%，4分。最后以兩項評分的乘積判定結(jié)果：(1)0分，陰性；(2)1～3分，弱陽性；(3)4～6分，中度陽性；(4)7～12分，強陽性。統(tǒng)計分析時，≥4分定為高表達，<4分定為低表達。

臨床隨訪與記錄通過患者門診、病房復查及電話回訪等方式對其進行術(shù)后隨訪，隨訪起止日期為2012年1 月9日至2018年5月31日。終點事件定義為患者死于胃癌復發(fā)或轉(zhuǎn)移，刪失數(shù)據(jù)包括隨訪日期截止患者仍存活、患者失訪、患者死于其他病因或意外。記錄患者的生存時間，以月為單位。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料間的比較采用Pearsonχ2或連續(xù)性校正的χ2檢驗，多個計數(shù)資料間的多重比較采用χ2分割法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組患者生存率的比較采用Log-rank檢驗；對可能影響胃癌預后的因素進行Cox單因素分析，將P<0.05的變量納入Cox比例風險回歸模型進行多因素分析，其中χ2分割法根據(jù)比較次數(shù)重新規(guī)定檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

SOX9蛋白在胃癌組織、腸化生組織和正常胃黏膜組織中的表達在正常胃黏膜中，SOX9的陽性染色主要定位于胞漿；在胃癌組織中以胞核、胞漿混合性表達為主，其胞核染色明顯增強(圖1)。SOX9在胃癌組織、腸化生組織和正常胃黏膜組織中的高表達率分別為92.9%(65/70)、77.8%(21/27)和55.8%(24/43)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.722，P<0.001)；其中，SOX9在胃癌組織中的高表達率明顯高于正常胃黏膜組織(χ2=21.850，P<0.001)。單獨觀察胞核內(nèi)染色發(fā)現(xiàn)，SOX9在胃癌組織、腸化生組織和正常胃黏膜組織中的高表達率依次為67.1%(47/70)、37.0%(10/27)和23.3%(10/43)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=22.129，P<0.001)；其中，SOX9在胃癌組織胞核內(nèi)的高表達率明顯高于腸化生組織(χ2=7.288，P=0.007)和正常胃黏膜組織(χ2=20.524，P<0.001)(表1)。

GKN1蛋白在胃癌組織、腸化生組織和正常胃黏膜組織中的表達GKN1主要在正常胃黏膜中表達，陽性染色定位于胞漿(圖2)。在胃癌組織、腸化生組織和正常胃黏膜組織中，GKN1的高表達率分別為37.1%(26/70)、44.4%(12/27)和76.7%(33/43)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=17.239，P<0.001)；其中，GKN1在正常胃黏膜組織中的高表達率明顯高于腸化生組織(χ2=7.537，P=0.006)和胃癌組織(χ2=16.742，P<0.001)(表1)。

SOX9：Y染色體性別決定基因相關(guān)的高速泳動蛋白家族9

SOX9：Sry-related high mobility group box 9

A.正常胃黏膜組織中低表達(胞漿弱陽性，胞核陰性)；B.腸化生組織中高表達(胞漿強陽性，部分胞核弱陽性)；C.中分化胃癌中高表達(胞漿強陽性，胞核中度陽性)；D.低分化胃癌中高表達(胞漿、胞核均強陽性)

A. low expression in normal gastric mucosa(weakly positive staining in cytoplasm and negative staining in nucleus)；B.high expression in intestinal metaplasia(strongly positive staining in cytoplasm and weakly positive staining in parts of the nucleus)；C.high expression in moderately differentiated gastric cancer(strongly positive staining in cytoplasm and moderately positive staining in nucleus)；D. high expression in poorly differentiated gastric cancer(strongly positive staining in both nucleus and cytoplasm)

圖1SOX9在胃癌和癌旁組織中的表達(免疫組織化學染色，×400)

Fig1Expression of SOX9 in gastric carcinoma and adjacent tissue(immunohistochemistry，×400)

表1 SOX9和GKN1在胃癌組織、腸化生組織和正常胃黏膜組織中的表達[n(%)]Table 1 Expressions of SOX9 and GKN1 in gastric cancer，intestinal metaplasia，and normal gastric mucosa[n(%)]

SOX9：Y染色體性別決定基因相關(guān)的高速泳動蛋白家族9；GKN1：胃動蛋白1；多個樣本率間的兩兩比較采用χ2分割法，組數(shù)為3時，α’=0.0125；與胃癌組比，a：連續(xù)校正的χ2=3.034，P=0.082；b：χ2=21.850，P<0.001；d：χ2=0.436，P=0.509；e：χ2=16.742，P<0.001；g：χ2=7.288，P=0.007；h：χ2=20.524，P<0.001；與腸化生組比：c：χ2=3.485，P=0.062；f：χ2=7.537，P=0.006；i：χ2=1.543，P=0.214

SOX9：Sry-related high mobility group box 9；GKN1：gastrokine- 1；χ2segmentation method was used in multiple comparisons among multiple sample rates when the number of groups is 3，α’=0.0125；a：χ2test with continuity correction，χ2=3.034，P=0.082；b：χ2=21.850，P<0.001；d：χ2=0.436，P=0.509；e：χ2=16.742，P<0.001；g：χ2=7.288，P=0.007；h：χ2=20.524，P<0.001 compared with gastric cancer group；c：χ2=3.485，P=0.062；f：χ2=7.537，P=0.006；i：χ2=1.543，P=0.214 compared with intestinal metaplasia group

GKN1：胃動蛋白1

GKN1：gastrokine- 1

A.正常胃黏膜組織中高表達(強陽性)；B.腸化生組織中高表達(中度陽性)；C.高分化胃癌中低表達(弱陽性)；D.低分化胃癌中低表達(陰性)

A. high expression in normal gastric mucosa(strongly positive)；B.high expression in intestinal metaplasia(moderately positive)；C. low expression in well-differentiated gastric cancer(weakly positive)；D.low expression in poorly-differentiated gastric cancer(negative)

圖2GKN1在胃癌和癌旁組織中的表達(免疫組織化學染色，×400)

Fig2Expression of GKN1 in gastric carcinoma and adjacent tissue(immunohistochemistry，×400)

胃癌組織中GKN1的表達和SOX9在胞核內(nèi)的表達與臨床病理特征的關(guān)系胃癌組織中，SOX9在胞核內(nèi)的表達與組織分化程度有關(guān)(χ2=9.922，P=0.007)，其在低分化胃癌胞核內(nèi)的表達明顯高于高分化胃癌(校正χ2=7.531，P=0.006)；而GKN1的表達與組織的分化程度(χ2=12.113，P=0.002)和是否為印戒細胞癌有關(guān)(χ2=6.746，P=0.009)，其在印戒細胞癌中的表達明顯低于其他病理類型的胃腺癌，在低分化胃癌中的表達顯著低于高分化(校正χ2=7.531，P=0.006)和中分化胃癌(χ2=7.249，P=0.007)(表2)。

表2 GKN1的表達和SOX9在胞核內(nèi)的表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]Table 2 Relationships of the GKN1 expression and the nuclear expression of SOX9 in gastric cancer tissue with the clinicopathological features of gastric cancer patients[n(%)]

多個樣本率間的兩兩比較采用χ2分割法，組數(shù)為3時，α’=0.0125；與低分化胃癌組比，a：連續(xù)性校正的χ2=7.531，P=0.006；c：χ2=2.963，P=0.085；d：連續(xù)性校正的χ2=7.531，P=0.006；f：χ2=7.249，P=0.007；與中分化胃癌組相比，b：連續(xù)性校正的χ2=1.567，P=0.211；e：連續(xù)校正的χ2=0.324，P=0.569

χ2segmentation method was used in multiple comparisons between multiple sample rates，when the number of groups is 3，α’=0.0125；a：χ2test with continuity correction，χ2=7.531，P=0.006；c：χ2=2.963，P=0.085：d：χ2test with continuity correction，χ2=7.531，P=0.006；f：χ2=7.249，P=0.007 compared with poorly differentiated gastric cancer；b：χ2test with continuity correction，χ2=1.567，P=0.211；e：χ2test with continuity correction，χ2=0.324，P=0.569 compared with moderately differentiated gastric cancer

胃癌組織中SOX9在胞核內(nèi)的表達與GKN1表達的相關(guān)性70例患者中，胃癌組織中SOX9胞核內(nèi)高表達47例，其中，GKN1高表達10例，GKN1低表達37例；SOX9胞核內(nèi)低表達23例，其中，GKN1高表達16例，GKN1低表達7例；SOX9在胞核內(nèi)的表達與GKN1的表達呈顯著負相關(guān)(χ2=15.424，P<0.001)。

預后分析70例胃癌患者的中位隨訪時間為42.5個月(5～75個月)，其中6例失訪，38例死亡，隨訪率為85.71%；中位生存時間為51個月(95%CI：33.7～68.3個月)；術(shù)后5年總生存率為45.0%。將病例分組后采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結(jié)果顯示，SOX9在胞核內(nèi)高表達組與低表達組的患者中位生存時間分別為39個月(95%CI：21.7～56.3個月)和>71個月；5年生存率分別為33.8%和 67.5%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.811，P=0.016)(圖3)。GKN1高表達組和低表達組的患者中位生存時間分別為>71個月和39個月(95%CI：22.9～55.1個月)；5年生存率分別為60.0%和35.6%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.062，P=0.044)(圖4)。進一步研究表明，在37例SOX9胞核內(nèi)高表達且GKN1低表達的胃癌患者中，中位生存時間為37個月(95%CI：26.2～47.8個月)，5年生存率為28.8%。

圖3SOX9在胃癌組織胞核內(nèi)高表達組與低表達組患者的生存曲線

Fig3Survival curves of patients with high and low nuclear expressions of SOX9 in gastric cancer

以患者是否因胃癌復發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡與患者的生存時間作為應變量，單因素Cox回歸分析結(jié)果表明，胃癌的大體類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、分化程度、GKN1的表達水平和SOX9在胞核內(nèi)的表達水平與胃癌患者的生存期有關(guān)(P均<0.05)。將這些變量(浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移已經(jīng)體現(xiàn)在TNM分期中，故未納入)納入Cox比例風險回歸模型，進一步多因素結(jié)果分析顯示，TNM分期晚(Ⅱ期：HR=7.435，95%CI：1.313～42.096，P=0.023；Ⅲ期：HR=12.214，95%CI：2.677～55.721，P=0.001)和SOX9蛋白在胞核表達水平高(HR=3.297，95%CI：1.199～9.065，P=0.021)是影響胃癌患者預后的獨立危險因素(表3)。

圖4GKN1在胃癌組織中高表達組與低表達組患者的生存曲線

Fig4Survival curves of patients with high and low expression of GKN1 in gastric cancer

表3 Cox比例風險回歸模型對胃癌患者預后的單因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analyses of the prognosis of gastric cancer patients by Cox proportional hazard regression model

討 論

SOX基因家族由Y染色體的性別決定區(qū)域(sex determination region of Y Chromosome，SRY)相關(guān)的基因組成，SOX9是SOX家族的E亞組成員之一[7]，在成體(包括胃腸道)干細胞的分化和自我更新中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在多種不同來源的腫瘤中表達并存在差異[8]。SOX9已被確定為β-catenin的下游靶蛋白，兩者之間存在調(diào)控環(huán)，經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的過度活化與胃癌的發(fā)生相關(guān)[4- 5]，而SOX9在胃癌中的相關(guān)研究較少，且結(jié)果存在爭議。Liu等[9]通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)SOX9在胃癌組織中表達增加，并與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。其他實驗也表明，SOX9 在晚期胃癌中過度表達[5，10]，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。也有研究顯示，SOX9在早期胃癌中高表達，但在晚期胃癌的表達出現(xiàn)下調(diào)[11- 12]。 Zhang等[13]同樣發(fā)現(xiàn)SOX9在胃癌中表達上調(diào)，但未得出與臨床病理因素存在相關(guān)性的結(jié)論。本研究結(jié)果顯示，SOX9在正常胃黏膜組織、腸化生組織和胃癌組織中的表達依次升高，其高表達率分別為55.8%、77.8%和92.9%，與Liu等[9]研究結(jié)果相似。SOX9的陽性染色定位于胞核與胞漿，其在胃癌組織胞核內(nèi)的高表達率(67.1%)明顯高于腸化生組織(37.0%)和正常胃黏膜組織(23.3%)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，SOX9在胞核內(nèi)的表達水平與組織的分化程度相關(guān)，但與TNM分期等其他臨床病理因素無關(guān)，而Choi等[12]認為SOX9在晚期胃癌中表達下調(diào)，本研究則發(fā)現(xiàn)SOX9在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期胃癌中胞核內(nèi)的高表達率分別為72.0%、40.0%和71.4%，差異無統(tǒng)計學意義，后續(xù)可納入Ⅳ期胃癌標本并增加樣本量進一步證實。這些研究結(jié)果表明，SOX9在胃癌組織中的過度表達以胞核染色增加為主要表現(xiàn)。這一生物學行為可能與胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其在胞核內(nèi)的表達水平可能直接或間接影響腫瘤的惡性程度，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的特點，筆者推測這種生物學行為可能是SOX9蛋白在胞質(zhì)內(nèi)合成增多并過度活化而進入細胞核參加轉(zhuǎn)錄調(diào)控的過程，深入研究SOX9的入核與轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制可能有助于胃癌發(fā)病機制的認識及其生物學行為的干預。

GKN1是胃動蛋白家族的成員之一，在人胃黏膜組織的表達具有促進上皮細胞的增殖和損傷后修復等作用。Yoon等[14]采用免疫組織化學方法分別在36例(90%)和170例(89.5%)腺瘤和胃癌患者中檢測到GKN1表達的減少或缺失。本研究結(jié)果顯示，GKN1在正常胃黏膜中表達豐富(76.7%)，在腸化生和胃癌組織中表達下降，其高表達率分別為44.4%和37.1%，與Mao等[15]研究結(jié)論一致。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，GKN1在胃癌中的表達降低與組織的分化程度和病理類型是否為印戒細胞癌相關(guān)，這同樣提示GKN1的表達下調(diào)與胃癌的惡性程度有關(guān)。如上所述，GKN1在胃黏膜處于癌前病變時便開始出現(xiàn)表達下降，這可能與早期胃癌的發(fā)生有關(guān)，目前已有不少相關(guān)分子機制的研究，但無明確的定論。Yoon等[16- 17]研究認為，GKN1可抑制與幽門螺桿菌感染相關(guān)的CagA所產(chǎn)生的致癌作用，并通過降低RhoA的表達來阻止胃癌細胞的侵襲和遷移。GKN1也可能通過P21waf和p16/Rb通路的活化來誘導胃癌細胞的衰老和凋亡[18]。此外，GKN1的表達能夠抑制EMT和胃癌細胞的遷移，這伴隨著E-cadherin的重新表達和β-catenin的表達下降[3]，SOX9則通過 Wnt/β-catenin 通路影響胃癌細胞的增殖。本研究結(jié)果表明，在胃癌組織中，SOX9在胞核內(nèi)的表達與GKN1的表達呈負相關(guān)，與Choi等[12]研究結(jié)果一致，其體外實驗還證明，GKN1的異常表達能夠抑制SOX9在AGS和MKN- 1胃癌細胞中的表達。但兩者的直接調(diào)控關(guān)系有待深入研究。

既往研究顯示，SOX9在結(jié)直腸癌中的過度表達影響了患者術(shù)后的生存時間[19]。本研究隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOX9在胃癌組織胞核內(nèi)的高表達和TNM分期晚是影響患者預后的獨立危險因素。Santos等[5]也認為SOX9的高表達與胃癌患者較低的總生存率和無病存活率相關(guān)，但Choi等[12]研究認為，SOX9在胃癌中的過度表達與患者總體生存率的關(guān)系無統(tǒng)計學意義。Moss 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，GKN1在腸型胃癌中表達下降與不良預后有關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果，GKN1雖不是胃癌患者的獨立預后因素，但在低表達組中，患者的中位生存時間和5年生存率明顯低于高表達組，提示前者預后相對較差，后續(xù)研究可增加樣本量后進一步探討。本研究還發(fā)現(xiàn)，在SOX9胞核高表達且GKN1低表達胃癌患者中，其中位生存時間和5年生存率更低，結(jié)合兩蛋白在胃癌中的表達的負相關(guān)性，同時檢測兩者在胃癌中的表達可能更有助于患者的預后評估。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOX9在胃癌組織中的表達增加，其在胞核內(nèi)的表達水平與組織分化程度有關(guān)；而GKN1在胃癌組織中的表達下降，其表達水平與組織分化程度和是否為印戒細胞癌有關(guān)；兩者表達呈負相關(guān)，SOX9和GKN1的表達變化可能在胃癌的惡性生物學行為中發(fā)揮重要作用。SOX9在胃癌組織胞核內(nèi)的高表達和TNM分期晚是影響患者預后的獨立危險因素，SOX9可能是胃癌患者的潛在預后標志物。聯(lián)合檢測SOX9和GKN1的表達情況并進一步研究其分子作用機制可能為胃癌的早期診斷、靶向治療以及預后評估提供新思路。

(志謝：感謝中國醫(yī)科大學碩士研究生導師蔡相軍和劉洪濤教授在實驗設(shè)計、實施以及論文撰寫中提出的寶貴意見；感謝實驗室老師提供的技術(shù)指導；感謝北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平分院普外科、病案室為研究提供了詳細的臨床病例資料；感謝病理科為實驗提供了寶貴的病理資料和蠟塊組織并協(xié)助完成了實驗后期的閱片評分工作)