任艷萍，柳瓊友，雷小燦

遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，貴州遵義 563003

胎兒染色體非整倍性是流產(chǎn)和新生兒出生缺陷的主要原因之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，胎兒染色體非整倍性大多來(lái)自卵母細(xì)胞(精子占比4%～5%，卵母細(xì)胞占比 約95%)[2]。卵母細(xì)胞染色體非整倍性與女性年齡呈正相關(guān)，高齡女性(>35歲)卵母細(xì)胞染色體非整倍率顯著上升[1， 3-4]。Kuliev等[5]對(duì)2830位女性的20 986顆卵母細(xì)胞進(jìn)行FISH檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)35～45歲女性的卵母細(xì)胞染色體非整倍率高達(dá)46.8%。因此，卵母細(xì)胞染色體非整倍性是導(dǎo)致女性不孕、流產(chǎn)以及新生兒畸形的重要原因[6]。近年來(lái)，隨著婚育年齡的逐年上升，年齡相關(guān)卵母細(xì)胞非整倍性對(duì)女性生殖健康和家庭幸福的威脅日益加劇，急需展開(kāi)該領(lǐng)域的相關(guān)科學(xué)研究。本文將從SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修飾對(duì)卵母細(xì)胞中Cohesin蛋白復(fù)合物的作用及其對(duì)微管動(dòng)力學(xué)的影響兩方面，分別探討SUMO化修飾在姐妹染色單體過(guò)早分離型和非分離型卵母細(xì)胞非整倍性中的作用。

SUMO化修飾

蛋白翻譯后修飾有磷酸化、乙?；?、泛素化、SUMO化等多種途徑。其中，SUMO化修飾作為一種翻譯后修飾，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及周期調(diào)控等眾多生理調(diào)控過(guò)程[7]。近期研究發(fā)現(xiàn)，SUMO化修飾在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂方面發(fā)揮重要作用[8- 10]。

SUMO化修飾相關(guān)因子

SUMO蛋白家族：SUMO蛋白家族包含4個(gè)成員，分別是SUMO- 1、SUMO- 2、SUMO- 3和SUMO- 4。其中，SUMO- 2和SUMO- 3的同源性很高，僅在N段存在3個(gè)氨基酸殘基的差別，因此常被稱為SUMO- 2/3[11]；SUMO- 4只在腎臟、脾臟以及一些免疫組織中檢測(cè)到其表達(dá)[12]。

SUMO化修飾相關(guān)酶：SUMO蛋白酶家族(sentrin-specific protease，SENPs)具有催化SUMO蛋白前體成熟，將SUMO蛋白從底物上移除的功能，包含6個(gè)成員，分別是SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6和SENP7[13]。哺乳動(dòng)物的E1酶是由SAE1-SAE2(又名AOS1-UBA2)異源二聚體組成的復(fù)合物，在調(diào)控細(xì)胞周期由G2向M期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用[14]。迄今發(fā)現(xiàn)的E2結(jié)合酶只有UBC9一種，該酶可識(shí)別底物上的蛋白結(jié)合保守序列ΨKxD/E(Ψ代表1個(gè)大的疏水氨基酸殘基，K代表賴氨酸，x代表任意氨基酸，D代表天冬氨酸，E代表谷氨酸)，并完成底物的SUMO化修飾[15]。在哺乳動(dòng)物中，E3連接酶由活化的STATs抑制劑(protein inhibitor of activated STATs proteins，PIAS)1、PIAS3、PIASx和PIASy基因編碼，敲除后對(duì)小鼠發(fā)育無(wú)顯著影響，推測(cè)其可能并不是SUMO化修飾所必需的[16]。

SUMO化修飾過(guò)程SUMO化修飾過(guò)程可分為以下5步：(1)SUMO蛋白前體經(jīng)SENPs移除C端的幾個(gè)氨基酸，暴露出2個(gè)甘氨酸殘基，形成具有生物活性的成熟的SUMO蛋白；(2)成熟的SUMO蛋白的甘氨酸殘基與由SAE1-SAE2異源二聚體組成的E1酶的半胱氨酸殘基結(jié)合，發(fā)生腺苷?；?；(3)SUMO蛋白被轉(zhuǎn)移到E2結(jié)合酶Ubc9的半胱氨酸殘基上，形成E2-SUMO硫脂復(fù)合物；(4)在E3連接酶的作用下，SUMO蛋白的2個(gè)甘氨酸殘基與底物的賴氨酸殘基之間形成異肽鍵；(5)在SENPs或去SUMO化異肽酶(desumoylating isopeptidase，DeSI)的作用下，SUMO蛋白從底物上解離，又可進(jìn)入新的SUMO化過(guò)程[17]。

SUMO化修飾影響卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂率和第一極體排放率

在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的pre-MⅠ期、MⅠ期和MⅡ期，SUMO- 1定位于紡錘體的兩極，SUMO2則集中定位于著絲粒附近[8]。通過(guò)向GV期小鼠卵母細(xì)胞顯微注射SUMO- 1的SiRNA或SUMO- 1抗體，抑制SUMO- 1的表達(dá)或功能，生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)率和第一極體(first polar body，PB1)排放率顯著降低[9]。由此可見(jiàn)，SUMO蛋白家族對(duì)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂有重要影響[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SENP2導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞MⅡ期紡錘體形成缺陷[19]。在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂期間，SENP3與紡錘體共定位，抑制SENP3導(dǎo)致GVBD和PB1排放率降低，微管組織中心(microtubule organizing centers，MTOCs)定位所必需的AuroraA表達(dá)水平下降且在紡錘體上的定位顯著減少，SUMO- 2/3介導(dǎo)的SUMO化修飾下調(diào)[10]。泛素綴合酶9(ubiquitin conjugating enzymes 9，UBC9)在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂各時(shí)期均有表達(dá)[20]，抑制UBC9可顯著降低小鼠卵母細(xì)胞GVBD率和PB1排放率[9]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SUMO化修飾相關(guān)酶對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂具有重要影響。

SUMO化修飾對(duì)卵母細(xì)胞染色體非整倍性的影響

目前普遍認(rèn)為，在女性出生后幾天起至排卵前GVBD期間，卵母細(xì)胞的長(zhǎng)期停滯是導(dǎo)致卵母細(xì)胞非整倍率遠(yuǎn)高于精子的主要原因[21]。卵母細(xì)胞非整倍性主要來(lái)源于以下兩類異常：(1)姐妹染色單體的過(guò)早分離，即姐妹染色單體分離異常(prematurely separated sister chromatids，PSSCs)；(2)完整姐妹染色體對(duì)分離異常，稱為非分離型[22]。

SUMO化修飾影響Cohesin蛋白復(fù)合物長(zhǎng)期以來(lái)，Cohesin蛋白復(fù)合物丟失假說(shuō)一直是卵母細(xì)胞非整倍性發(fā)生的主流分子機(jī)制：Cohesin是一種綁定同源染色體或姐妹染色單體的環(huán)形蛋白復(fù)合物，在從DNA復(fù)制到中期結(jié)束前，該復(fù)合物具有維持染色體間聚合的作用[23]；隨著母源年齡的增長(zhǎng)，卵母細(xì)胞的長(zhǎng)期停滯致使Cohesin蛋白復(fù)合物從染色體上逐漸丟失，姐妹染色體提前分離，最終形成非整倍性卵母細(xì)胞[24- 26]。但該假說(shuō)不適用于解釋，在青年和高齡小鼠卵母細(xì)胞核質(zhì)互換實(shí)驗(yàn)中，青年小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)可挽救高齡小鼠卵母細(xì)胞細(xì)胞核的AⅠ期染色體遲滯的現(xiàn)象[27]。因此，Cohesin蛋白復(fù)合物降解假說(shuō)更適合解釋PSSCs導(dǎo)致的卵母細(xì)胞非整倍性，不適用于解釋以AⅠ期染色體遲滯(完整的姐妹染色體對(duì)遲滯)為主要特征的非分離型卵母細(xì)胞非整倍性[27- 29]。

酵母有絲分裂研究中，將Cohesin蛋白復(fù)合物去SUMO化后，姐妹染色單體分離，表明SUMO化修飾在Cohesin蛋白復(fù)合物凝集姐妹染色單體過(guò)程中發(fā)揮重要作用[30- 32]。對(duì)細(xì)胞有絲分裂的研究發(fā)現(xiàn)，Cohesin、condensin等復(fù)合物的SUMO化狀態(tài)對(duì)姐妹染色體凝集情況有重要影響[33]。抑制小鼠卵母細(xì)胞中SUMO- 1和UBC9的表達(dá)，Cohesin蛋白復(fù)合物的關(guān)鍵組成蛋白減數(shù)分裂重組蛋白(meiotic recombination protein，REC8)在紡錘體與染色體上的定位顯著減少，卵母細(xì)胞非整倍率顯著上升；同時(shí)SOMO- 1在老齡小鼠GV期卵母細(xì)胞中的表達(dá)和定位減少[9]。這些研究表明，SUMO化修飾是Cohesin蛋白復(fù)合物凝集姐妹染色單體所必須的。

減數(shù)分裂后期，Cohesin蛋白復(fù)合物的REC8亞基被Separase裂解，Cohesin從染色體上解離，染色體分離[34]。在后期之前，SGO2保護(hù)REC8，使其免遭Separase的作用而水解，敲除SGO2卵母細(xì)胞PSSCs率顯著上升[35]。SGO2與年齡呈負(fù)相關(guān)，高齡雌性小鼠卵母細(xì)胞中，著絲點(diǎn)區(qū)域SGO2蛋白減少，PSSCs率顯著上升[36- 37]。此外，Separase還受到兩個(gè)獨(dú)立抑制途徑的調(diào)控：(1)Separase與其抑制劑Securin結(jié)合；(2)磷酸化的Separase通過(guò)cyclin B1與周期蛋白依賴性激酶Cdk1結(jié)合[38- 39]。在卵細(xì)胞中，抑制Securin或Cdk1均可提高Separase活性，引發(fā)PSSCs[40]。APC/CCdc20通過(guò)水解Securin和cyclin B1激活Separase[38]；而在進(jìn)入后期之前，紡錘體裝配檢查點(diǎn)(the spindle-assembly checkpoint，SAC)識(shí)別并水解APC/CCdc20，以避免PSSCs[41]。分別抑制Bub1和Mad2這2個(gè)SAC的關(guān)鍵組成均可導(dǎo)致PSSCs[42- 43]。

Pelisch等[44]在線蟲(chóng)中證實(shí)BUB- 1是SUMO化底物；Xiao等[45]在細(xì)胞水平上研究發(fā)現(xiàn)，抑制SUMO化可抑制Cdk1活性；Shabbeer等[46]在乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，cyclin B1是SUMO化底物。本文將小鼠的Separase、Securin、Cdk1、cyclin B1、Bub1、Mad2和SGO2這7個(gè)Cohesin蛋白復(fù)合物調(diào)控因子進(jìn)行SUMO化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有7個(gè)調(diào)控因子的蛋白序列都存在高可能性的SUMO化修飾位點(diǎn)，其中Separase、Cdk1、cyclin B1、Bub1和SGO2這5個(gè)調(diào)控因子均存在至少1個(gè)評(píng)分0.9以上的SUMO化修飾位點(diǎn)(表1)。因此，可推測(cè)在Cohesin蛋白復(fù)合物調(diào)控因子中存在多個(gè)SUMO化修飾底物，SUMO化修飾通過(guò)調(diào)節(jié)這些底物的活性，影響卵母細(xì)胞非整倍性。

SUMO化修飾影響紡錘體微管動(dòng)力學(xué)近年研究發(fā)現(xiàn)，在紡錘體形成的早期階段，大約一半的高齡雌性卵母細(xì)胞出現(xiàn)瞬時(shí)多極紡錘體現(xiàn)象，且該現(xiàn)象與MⅠ期中板集合延遲、AⅠ期染色體遲滯和非整倍性卵母細(xì)胞的發(fā)生率呈正相關(guān)[28， 47]。2017年 Nakagawa等[27]研究發(fā)現(xiàn)，高齡小鼠的卵母細(xì)胞中存在明顯的紡錘體微管動(dòng)力學(xué)改變，誘發(fā)卵母細(xì)胞出現(xiàn)瞬時(shí)的多極紡錘體現(xiàn)象，導(dǎo)致微管-動(dòng)粒黏附缺陷和非分離型卵母細(xì)胞非整倍性；且青年和高齡小鼠卵母細(xì)胞核質(zhì)互換實(shí)驗(yàn)證明，高齡小鼠卵母細(xì)胞出現(xiàn)瞬時(shí)多極紡錘體和AⅠ期染色體遲滯的現(xiàn)象是源于年齡相關(guān)細(xì)胞質(zhì)改變，與染色質(zhì)的變化無(wú)關(guān)。因此，微管動(dòng)力學(xué)改變是誘發(fā)高齡小鼠出現(xiàn)瞬時(shí)多極紡錘體，導(dǎo)致年齡相關(guān)的非分離型卵母細(xì)胞非整倍性的重要因素。

表1 Cohesin及其相關(guān)蛋白的SUMO化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 1 Predicted SUMOylation sites of Cohesin protein and related proteins

蛋白序列源自NCBI，SUMO化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)源自SUMOplotTM(www.abge nt.com/tools)；表中SUMO位點(diǎn)僅列出“高可能性的SUMO位點(diǎn)”中評(píng)分>0.9的位點(diǎn)，如沒(méi)有評(píng)分>0.9的位點(diǎn)則列出“高可能性的SUMO位點(diǎn)”中評(píng)分最高的一個(gè)位點(diǎn)

The protein sequence is from NCBI，and the SUMOylation site is predicted from SUMOplotTM(www.abge nt.com/tools)；the SUMOylation sites with the score of>0.9 are listed in the table；if there is no site with a score of>0.9，the highest scoring site is listed instead

在小鼠卵母細(xì)胞MⅠ期和MⅡ期，SUMO蛋白酶家族成員SENP7與卵母細(xì)胞紡錘體微管共定位，抑制SENP7的表達(dá)，γ位微管蛋白的錯(cuò)位定位，泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體降解γ位微管蛋白，導(dǎo)致紡錘體形態(tài)異常，無(wú)法通過(guò)紡錘體裝配檢查點(diǎn)[48]。SUMO- 1介導(dǎo)的SUMO化翻譯后修飾Plk1在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂紡錘體組裝中發(fā)揮重要作用，抑制劑抑制SUMO化修飾導(dǎo)致紡錘體形態(tài)異常率顯著上升[49]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SUMO化修飾可通過(guò)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞紡錘體動(dòng)力學(xué)，從而影響卵母細(xì)胞非整倍性。

綜上所述，卵母細(xì)胞非整倍性主要源于以下2個(gè)方面：Cohesin蛋白復(fù)合物丟失導(dǎo)致的姐妹染色單體的過(guò)早分離型卵母細(xì)胞非整倍性；以及紡錘體動(dòng)力異常導(dǎo)致的姐妹染色單體對(duì)非分離型卵母細(xì)胞非整倍性。SUMO化修飾即可調(diào)節(jié)Cohesin蛋白復(fù)在染色體上的定位，影響過(guò)早分離型卵母細(xì)胞非整倍性，同時(shí)可調(diào)節(jié)紡錘體動(dòng)力學(xué)，影響非分離型卵母細(xì)胞非整倍性(圖1)。由此可見(jiàn)，SUMO化修飾對(duì)卵母細(xì)胞染色體非整倍性具有重要作用，但尚不清楚SUMO化修飾是通過(guò)修飾哪些底物影響卵母細(xì)胞非整倍性，其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

實(shí)線：已證實(shí)；虛線：推測(cè)

Solid line：confirmed；Dotted line：predicted

圖1SUMO化修飾與卵母細(xì)胞非整倍性

Fig1SUMOylation and chromosomal aneuploidy in oocytes