高婭北，孫曙光，王勝雷，陳二龍，楊曉亮，孫占偉，宋朝鵬*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；

2 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430040；

3 福建省煙草公司，福建 福州 350003；

4 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450016

木質(zhì)素作為植物細(xì)胞壁的主要組成成分，與植物的抗倒伏能力、抗病性以及抗旱性等多種在生長發(fā)育過程中所形成的抗性特征密切相關(guān)[1-3]，但在卷煙原料的生產(chǎn)上，過高的木質(zhì)素含量會對卷煙產(chǎn)品燃吸時的感官質(zhì)量以及安全性方面產(chǎn)生不利影響[4]。而成熟期是植物生長發(fā)育的關(guān)鍵時期，因此，探究成熟期烤煙木質(zhì)素代謝機理可以合理調(diào)控?zé)熑~的木質(zhì)素含量，對促進優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)以及優(yōu)質(zhì)卷煙產(chǎn)品的生產(chǎn)具有重要意義。目前，國內(nèi)外學(xué)者對于木質(zhì)素的合成途徑進行了大量研究，主要集中于2個方面，一是苯丙烷類代謝途徑，即木質(zhì)素與其他酚類物質(zhì)合成所用的公共路徑，主要包括PAL（苯丙氨酸解氨酶）、C4H（肉桂酸4-羥化酶）、4CL（4-香豆酰CoA連接酶）3種關(guān)鍵酶類，他們的基因表達量對木質(zhì)素及其他酚類物質(zhì)的生物合成及含量高低有重要影響[5-7]；二是木質(zhì)素單體合成的特異路徑，主要包括上游的C3H（香豆酸3-羥化酶）、HCT（莽草酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶）、COMT（咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶）、CCoAOMT（咖啡酰CoA-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）和F5H（阿魏酸5-羥基化酶）以及下游的CCR（羥基肉桂酰CoA還原酶）、CAD（肉桂酸脫氫酶）和PAO（多胺氧化酶），這些合成酶基因表達量的高低不僅影響木質(zhì)素含量的高低，還對其單體的組成有較大影響[8-11]。但關(guān)于煙草木質(zhì)素合成路徑的研究多集中于木質(zhì)素與其他酚類物質(zhì)合成的共用路徑以及合成特異途徑中的少數(shù)幾個合成關(guān)鍵酶方面[12-14]，缺乏對其的合成路徑進行全面系統(tǒng)深入的研究，對于烤煙煙葉成熟過程中木質(zhì)素合成積累的關(guān)鍵時期及合成關(guān)鍵酶基因尚不清楚。本研究以K326為材料，測定煙株成熟期煙葉生長發(fā)育過程的中部葉片硬度、葉片組織結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素含量，應(yīng)用qRT-PCR（熒光定量PCR）方法分析木質(zhì)素合成路徑上的12個相關(guān)合成酶基因PAL、C4H、4CL1、4CL2、C3H、F5H1、HCT1、CCR1、CCoAOMT5、COMT1、CAD2和PAO1的表達量，探究烤煙木質(zhì)素在成熟期的合成規(guī)律、合成積累的關(guān)鍵點及其關(guān)鍵酶基因表達規(guī)律，旨在系統(tǒng)探究煙葉木質(zhì)素合成的分子調(diào)控機制，為烤煙品種選育及優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

田間試驗于2018年在河南省洛陽市洛寧縣煙草科技示范基地（地處東經(jīng)111°38＇，北緯34°26＇）進行。試驗田植煙土壤為黃棕壤，肥力中等，0～20 cm土層含有機質(zhì)13.54 g/kg、堿解氮75.16 mg/kg、速效磷9.16 mg/kg和速效鉀164.38 mg/kg，土壤pH 7.26。

選用K326為試驗品種。按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范種植管理，行距110 cm，株距55 cm，單株留葉數(shù)18～20片，煙田施氮量為72 kg/hm2，使用煙草專用復(fù)合肥，N : P2O5: K2O=1 : 1 : 2。在打頂后當(dāng)天、10 d、20 d、30 d、40 d和50 d進行取樣（打頂后30天中部葉達到適熟狀態(tài)），采集生長情況正常、葉片完整且朝向一致的烤煙中部葉（10～12葉位）20片，其中10片在采后立即去除主脈，混合第6至第7支脈葉肉樣品10 g左右，用錫紙和紗布包裹后放入液氮中速凍，于-80 ℃超低溫冰箱中進行保存，用于煙葉木質(zhì)素含量和相關(guān)合成酶基因表達量的測定，其余鮮煙葉用于葉片硬度及組織結(jié)構(gòu)測定。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 葉片硬度和組織結(jié)構(gòu)測定。

煙葉硬度測定參照蔣博文等[15]的方法，采用質(zhì)構(gòu)儀進行煙葉硬度測定；煙葉組織結(jié)構(gòu)測定參照宋朝鵬等[16]的方法，利用8 mm打孔器分別在打頂后當(dāng)天、30天和50天的葉片中部進行取樣，采用常規(guī)石蠟包埋染色處理，制片，在Olympus光學(xué)顯微鏡下利用測微尺對葉片、上下表皮、海綿組織、柵欄組織厚度進行測量[17]。

1.2.2 木質(zhì)素含量測定方法

將新鮮煙葉樣品在80 ℃下烘干至恒重，將干燥后的樣品磨碎過40目篩，稱取5 mg于10 ml玻璃試管中，采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的木質(zhì)素含量微量法試劑盒進行煙葉木質(zhì)素含量測定。

1.2.3 木質(zhì)素相關(guān)合成酶基因表達量分析

在NCBI的Gene數(shù)據(jù)庫（NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov）檢索煙草木質(zhì)素合成相關(guān)酶的編碼基因，分別獲得普通煙草PAL、C4H、4CL1、4CL2、C3H、F5H、HCT、CCR、CCoAOMT、COMT、CAD和PAO蛋白的編碼區(qū)序列（圖1）。將獲得的每個基因家族序列進行多序列比對，通過SMART（http://coot.embl-heidelberg.de/SMART）在線軟件預(yù)測基因的保守區(qū)域，利用Primer 5.0在基因的5'保守區(qū)域設(shè)計特異qRT-PCR引物（表1）。

采用Trizol法提取煙草樣品中總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA[18]。利用QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒（Qiagen，Germany）在LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀（Roche，Swiss）上進行qRT-PCR。選用煙草核糖體蛋白編碼基因NtL25作為內(nèi)參基因，反應(yīng)程序為：95 ℃30 s，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。實驗結(jié)果采用 2-ΔΔCt算法進行分析，確定各基因的相對表達量[19]。試驗設(shè)置3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用Microsoft Excel 2010進行試驗結(jié)果統(tǒng)計整理，運用Origin 2018進行圖片繪制，運用SPSS 22進行方差分析及通徑分析。

表1 煙草木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence of lignin-related synthetase gene in tobacco leaves

續(xù)表1

圖1 植物木質(zhì)素生物合成路徑（由文獻[20-21]修改而成）Fig.1 Biosynthesis pathway of lignin in plants (modification based on[20-21])

2 結(jié)果

2.1 K326煙葉硬度和組織結(jié)構(gòu)變化

由表2可見，煙葉硬度在打頂后的不同時期間差異顯著，表現(xiàn)為打頂后先升高而后降低的變化趨勢。煙葉在打頂后不同生長發(fā)育時期葉片厚度、上下表皮厚度、柵欄組織厚度以及海綿組織厚度之間存在著不同程度的差異，其中葉片厚度、柵欄組織厚度和葉片緊密度隨煙葉打頂后天數(shù)的增加而顯著減小，煙葉上表皮厚度和海綿組織厚度為打頂后30 d顯著高于其他兩時期，下表皮厚度則表現(xiàn)為打頂后30 d顯著低于其他兩時期；可見煙葉組織結(jié)構(gòu)會隨煙葉打頂后的生長發(fā)育發(fā)生明顯的變化，各時期間差異明顯。

表2 不同打頂時期煙葉硬度和組織結(jié)構(gòu)的變化Tab.2 Changes in hardness and tissue structure of tobacco leaves at different topping stages

2.2 煙葉木質(zhì)素含量變化

由圖2可見，不同時期間煙葉木質(zhì)素含量具有顯著差異，在打頂后的成熟階段，煙葉木質(zhì)素含量呈現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢，在成熟時（打頂后30天）含量達到最大值，而后隨成熟度進一步增加含量略有降低，這也與煙葉硬度的變化表現(xiàn)出較為一致的規(guī)律。表明成熟期煙葉木質(zhì)素含量變化較大，是其合成積累的重要時期。

2.3 木質(zhì)素相關(guān)合成酶基因的qRT-PCR表達量

由圖3可見，利用qRT-PCR技術(shù)對進入成熟期各發(fā)育階段的煙葉中木質(zhì)素合成上游、中游和下游各相關(guān)酶基因的相對表達量進行分析，結(jié)果表明各基因在煙葉組織中均有表達，但相對表達量各異。煙葉木質(zhì)素相關(guān)合成酶基因表達量除局部波動外基本都呈現(xiàn)出先上調(diào)而后下調(diào)的變化趨勢，在打頂后30 d其基因表達量最高，說明打頂后的煙葉成熟階段是木質(zhì)素合成積累的關(guān)鍵調(diào)控時期。

PAL、C4H、4CL1和4CL2基因為煙葉苯丙氨酸代謝途徑中調(diào)控木質(zhì)素和其他物質(zhì)合成的共用相關(guān)酶基因[22]，屬于煙葉木質(zhì)素合成途徑上游的相關(guān)酶基因。在本研究中，PAL、C4H、4CL1基因在成熟過程中基因表達量前后差異較明顯，且均在打頂后30 d基因表達量最高，而后迅速下調(diào)；PAL基因相對表達量呈先上調(diào)后下調(diào)的單峰曲線變化趨勢；C4H在打頂后20 d略有下調(diào)而后迅速上調(diào)；4CL1在打頂后表達量呈逐漸下調(diào)的趨勢，但前后差異不顯著；而4CL2基因表達量在成熟過程中前后變化不明顯；說明在木質(zhì)素合成的苯丙氨酸代謝途徑中，可能是PAL、C4H、4CL1基因所發(fā)揮的調(diào)控作用較大。

C3H、HCT1、COMT1、CCoAOMT5和F5H1是調(diào)控?zé)熑~中木質(zhì)素單體合成特異路徑上游的相關(guān)酶基因。在本研究中CCoAOMT5、COMT1和F5H1基因的相對表達量在煙葉成熟過程中前后差異較大，且除個別時期外，其基因表達量均呈先上調(diào)后下調(diào)的單峰曲線變化趨勢，在打頂后30 d其基因表達量最高；C3H和HCT1基因表達量在煙葉成熟過程中變化較??；說明在木質(zhì)素單體合成的特異途徑上游中，可能CCoAOMT5、COMT1和F5H1基因所發(fā)揮的調(diào)控作用較大。

CCR1、CAD2和PAO1基因是調(diào)控?zé)熑~木質(zhì)素單體合成特異路徑下游的相關(guān)酶基因。在本研究中這些基因的表達量在煙葉成熟期均變化較大，且呈先增加，在打頂后30 d達到最大而后迅速下調(diào)的單峰變化趨勢，說明這些調(diào)控木質(zhì)素單體合成的下游相關(guān)酶基因可能對木質(zhì)素的合成調(diào)控作用較大。

結(jié)合木質(zhì)素合成的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)PAL、C4H、4CL1、CCR1、CCoAOMT5、COMT1、CAD2、PAO1和F5H1基因表達規(guī)律與木質(zhì)素合成規(guī)律較為一致，其中PAL、C4H、CCR1、CAD2和PAO1的表達量變化較大，我們推測這些基因可能在煙葉打頂后成熟期生長發(fā)育階段的木質(zhì)素代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.4 木質(zhì)素含量與其合成相關(guān)酶基因表達量的相關(guān)性分析

由表3分析表明，木質(zhì)素含量與PAL、C4H、CCR1、CAD2和PAO1基因表達量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與4CL1、CCoAOMT5、COMT1、F5H1基因表達量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與4CL2、C3H和HCT1基因表達量相關(guān)性不顯著；PAL、C4H、4CL1、F5H1、HCT1、CCoAOMT5、COMT1、CAD2、CCR1和PAO1基因的表達有明顯的協(xié)同作用，相互之間的相關(guān)性達到顯著或是極顯著的關(guān)系，其表達量的變化趨勢也較為相似。4CL2和C3H基因的表達量變化趨勢與其他基因相差較大，其與木質(zhì)素含量之間相關(guān)系數(shù)較小，且基因表達量與木質(zhì)素含量之間為負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.5 木質(zhì)素含量與其合成相關(guān)酶基因表達量的通徑分析

由表4分析表明，煙葉木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因表達量對煙葉木質(zhì)素含量的影響程度相差較大，除4CL2和C3H的基因表達量對煙葉木質(zhì)素含量為負(fù)影響外，其他基因均為正影響。其中對木質(zhì)素含量影響較大的的是PAL、C4H、PAO1、CAD2和CCR1，直接通徑系數(shù)分別為0.24、0.19、0.19、0.17和0.16，且PAL、C4H和PAO1的間接通徑系數(shù)也較大，表明其他基因通過PAL、C4H和PAO1對木質(zhì)素含量均有較大的間接影響；雖然4CL1的間接通徑系數(shù)較小，表明其他基因通過4CL1對煙葉木質(zhì)素含量的間接影響略小，但4CL1基因表達量對木質(zhì)素含量有相對較大的直接影響，直接通徑系數(shù)為0.12；CCoAOMT5、COMT1和F5H1的基因表達量對木質(zhì)素含量影響差別不大。HCT1和4CL2對木質(zhì)素含量的影響較小，其中影響最小的是4CL2的表達量，直接通徑系數(shù)為-0.03?？芍?，影響木質(zhì)素含量變化的主要因素為PAL、C4H、PAO1、CAD2和CCR1的基因表達量。

圖3 煙葉成熟期木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因表達Fig.3 Gene expression of lignin biosynthesis in tobacco leaves at maturity stage

表3 木質(zhì)素含量與合成相關(guān)酶基因表達量的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between lignin content and expression quantity of lignin synthase-related genes

表4 木質(zhì)素含量與合成相關(guān)酶基因表達量的通徑分析Tab.4 Path analysis of lignin content and expression quantity of lignin synthase-related genes

3 討論

木質(zhì)素作為植物的細(xì)胞壁物質(zhì)，其與纖維素結(jié)合后可使植物細(xì)胞壁具有一定的硬度和強度，其含量變化可改變植物組織硬度，影響組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育，從而使植物具有一定的抗倒伏及抗病能力[23-24]。成熟期是木質(zhì)素代謝的關(guān)鍵時期，本研究表明各品種煙葉木質(zhì)素含量隨打頂天數(shù)的增加呈先增加后降低的變化趨勢，打頂后30天達到峰值，隨后煙葉衰老程度增加木質(zhì)素含量降低，這也與玉米等作物葉片成熟過程中木質(zhì)素含量的變化規(guī)律相一致[25-26]，也可能與隨著煙葉的衰老煙葉細(xì)胞壁物質(zhì)逐漸降解有關(guān)[27]；從煙葉在打頂后的硬度變化和組織結(jié)構(gòu)發(fā)育情況來看，煙葉硬度先增加后降低，這可能與在生長發(fā)育過程中的木質(zhì)素含量變化有關(guān)，這也與李玉菲[28]認(rèn)為的木質(zhì)素合成旺盛是造成煙葉偏硬的研究結(jié)果相一致；閆克玉等[29]研究認(rèn)為煙葉木質(zhì)素含量隨煙葉厚度的增加而減少，本研究呈現(xiàn)相似的研究結(jié)果，打頂30d后煙葉厚度減小可能是由于隨煙葉衰老，煙葉海綿組織以及柵欄組織逐漸萎縮引起的。

研究表明PAL、C4H、4CL1、4CL2、F5H1、HCT1、C3H、CCoAOMT5、COMT1、CAD2、CCR1和PAO1基因在木質(zhì)素的合成過程中發(fā)揮有重要的調(diào)控作用[30]，其表達量的大小與植物木質(zhì)素合成量的多少密切相關(guān)[31-33]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAL、C4H、4CL1、HCT1、CCoAOMT5、COMT1、CAD2、F5H1、CCR1和PAO1基因表達量基本呈單峰變化趨勢，隨成熟度的增加基因表達呈上調(diào)趨勢，在打頂后30天及適熟時達到最大值，而后隨葉片衰老表達量降低，這與黃杰恒等[34]的研究結(jié)果相一致，說明成熟期是煙葉木質(zhì)素合成的關(guān)鍵時期；4CL2基因表達量在成熟期變化規(guī)律不明顯，前后波動較大，與4CL1表達量變化趨勢差別較大，這表明4CL1基因?qū)δ举|(zhì)素合成的調(diào)控作用較大，4CL2基因?qū)δ举|(zhì)素合成的調(diào)控作用不大；C3H基因表達量在打頂后初期呈下調(diào)趨勢，可能受打頂后植物體內(nèi)生理生化反應(yīng)發(fā)生變化所影響，隨后變化不明顯，說明C3H表達量可能對烤煙葉片木質(zhì)素含量影響不明顯，這也與胡丹等[35]的研究結(jié)果一致。

相關(guān)分析及通徑分析表明，PAL、C4H、4CL1、HCT1、CCoAOMT5、F5H1和PAO1基因在與煙葉木質(zhì)素含量的相關(guān)系數(shù)及直接通徑系數(shù)較大，表明他們的相對表達量對煙葉木質(zhì)素的含量變化影響較大；C3H的基因表達量對木質(zhì)素合成會產(chǎn)生負(fù)向影響，但直接通徑系數(shù)較小，為-0.10，說明它們對烤煙葉片木質(zhì)素的合成具有負(fù)調(diào)控作用，如果在一定范圍內(nèi)降低其表達量，對木質(zhì)素的含量變化可能不會造成影響，但對于抑制其表達對烤煙煙葉木質(zhì)素合成的影響還需進一步研究。4CL1與4CL2為植物4CL家族基因，在本研究中，4CL2對煙葉木質(zhì)素的合成呈負(fù)向影響且直接通徑系數(shù)較小，這也與HU等[36]的研究結(jié)果一致，是由于二者的差異表達從而調(diào)控不同苯丙氨酸代謝途徑代謝產(chǎn)物的生物合成，4CL1主要參與木質(zhì)素的生物合成而4CL2主要參與類黃酮等物質(zhì)的生物合成所引起的。

4 結(jié)論

在烤煙中部葉打頂后進入成熟階段，煙葉木質(zhì)素含量呈先增加后降低的變化規(guī)律，打頂后0-30天是其合成積累的關(guān)鍵時期，在葉片成熟時（打頂后30天）其含量最高；研究其基因表達模式發(fā)現(xiàn)，PAL、C4H、CCR1、CAD2和PAO1基因?qū)熑~木質(zhì)素合成積累量的影響較大（p<0.01，r=0.93,0.90,0.91,0.90,0.89；P=0.24,0.19,0.16,0.17,0.19），是烤煙中部葉木質(zhì)素合成積累過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因。本研究從分子生物學(xué)角度探究了不同品種烤煙中部葉成熟期葉片木質(zhì)素合成及關(guān)鍵合成酶基因表達的規(guī)律，為烤煙木質(zhì)素代謝的分子作用機理提供了理論基礎(chǔ)。