郭娜 謝賓 劉興運(yùn)

摘要 [目的]研究小麥麩皮酸解液中糠醛和5-羥甲基糠醛經(jīng)活性炭吸附脫除處理及脫除后進(jìn)行發(fā)酵制備蘋果酸的可行性。[方法]通過添加不同濃度的糠醛、5-羥甲基糠醛，研究其對(duì)曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的影響;采用活性炭吸附方法，研究其對(duì)小麥麩皮酸解液中糠醛、5-羥甲基糠醛的脫除效果，并對(duì)脫毒后小麥麩皮酸解液進(jìn)行曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸。[結(jié)果]使用活性炭對(duì)小麥麩皮酸解液進(jìn)行脫毒處理，最適條件為活性炭含量1.5%、處理溫度30 ℃、時(shí)間40 min;在此條件下，小麥麩皮酸解液中的糠醛與5-羥甲基糠醛的脫除率分別達(dá)63.87%和61.49%。脫毒后的小麥麩皮酸解液可以作為發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的碳源，含有的糠醛與5-羥甲基糠醛含量顯著減少。[結(jié)論]經(jīng)活性炭處理后的小麥麩皮酸解液作為碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸是可行的。

關(guān)鍵詞 小麥麩皮;酸解液;脫毒;活性炭;糠醛;5-羥甲基糠醛;蘋果酸

中圖分類號(hào) TS210.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）11-0169-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.048

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective] The research aimed to study the feasibility of fermentation of furfural and 5HMF in wheat bran acid hydrolysate by adsorption and removal of activated carbon to prepare malic acid.[Method]The effects of fermentation on the production of malic acid by Aspergillus were studied by adding different concentrations of furfural and 5HMF.The activated carbon adsorption method was used to study the removal effect of furfural and 5HMF in wheat bran acid hydrolysate， and the malic acid fermentation of wheat bran acid hydrolysate was carried out to produce malic acid.[Result]The activated carbon was used to detoxify wheat bran acid hydrolysate.The optimum conditions were 1.5% activated carbon content， 30 °C treatment temperature and 40 min time. Under these conditions， the removal rates of furfural and 5hydroxymethylfurfural in wheat bran acid hydrolysate were 63.87% and 61.49%， respectively.The detoxified wheat bran acid hydrolysate could be used as a carbon source for the production of malic acid by fermentation， and the content of furfural and 5hydroxymethylfurfural was significantly reduced.

Key words Wheat bran;Acidolysis solution;Detoxification;Activated carbon;Furfural;5HMF;Malic acid

基金項(xiàng)目 合肥師范學(xué)院人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2014rcjj06）。

作者簡(jiǎn)介 郭娜（1984—），女，安徽蚌埠人，講師，博士，從事食品科學(xué)研究。

收稿日期 2018-11-08

L-蘋果酸是一種天然有機(jī)酸，因其口感與蘋果酸味接近，是一種優(yōu)良的酸味劑，被廣泛應(yīng)用于高檔飲料與食品行業(yè);其在醫(yī)藥上有著重要的作用，用于治療肝功能不全、肝衰竭和貧血等疾病[1-2]。目前依靠糧食作為原料發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸，隨著市場(chǎng)對(duì)其需求量的日益增大，采用非糧資源生產(chǎn)蘋果酸成為一種勢(shì)在必行的可行途徑。小麥麩皮是面粉副產(chǎn)物，富含纖維素、半纖維素等成分，在高溫條件下進(jìn)行酸解，可降解生成葡萄糖、木糖等碳水化合物，且酸解糖化率比較理想[3-4]，降解生成的碳水化合物可作為發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的原料，是一條增加蘋果酸的生產(chǎn)原料、降低生產(chǎn)成本的可持續(xù)發(fā)展途徑。

研究表明，纖維素稀酸水解產(chǎn)物含有的呋喃衍生物、酚類，如糠醛、5-羧甲基糠醛（5-HMF）是后期發(fā)酵菌種生長(zhǎng)和發(fā)酵的主要抑制物，必須經(jīng)過處理才能利用[5-6]。Cavka等[7]利用硼氫化鈉在20 ℃和pH 6.0的條件下處理云杉木質(zhì)纖維水解物，有效地降低了抑制物（對(duì)苯醌、2，6-二甲氧基苯醌和糠醛等）的含量，使生物乙醇的產(chǎn)率從0.02 g/g提高至0.30 g/g。Chen等[8]通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法脫毒，脫毒效果良好，其中可揮發(fā)性呋喃的脫除率達(dá)98%。Lee等[9]通過電化學(xué)聚合方法去除木質(zhì)纖維素中的酚類化合物，有效地脫除了稻草水解產(chǎn)物中的酚類物質(zhì)，達(dá)到降低抑制作用的效果。李志強(qiáng)等[10]利用石墨化碳對(duì)竹材稀酸預(yù)處理液中的發(fā)酵抑制物進(jìn)行脫除效果研究，結(jié)果表明石墨化碳能夠有效脫除發(fā)酵抑制物，脫除率達(dá)99%，脫毒后的預(yù)處理液可用于乙醇發(fā)酵。

筆者通過添加不同濃度的糖醛、5-羥甲基糠醛，研究其對(duì)曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的影響;采用活性炭吸附方法，研究其對(duì)小麥麩皮酸解液中糠醛、5-羥甲基糠醛的脫除效果，并對(duì)脫毒后小麥麩皮酸解液進(jìn)行曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸，探究小麥麩皮酸解液作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的可行性。

1 材料與方法

1.1 試材

小麥麩皮（合肥市場(chǎng)購買）;寄生曲霉（CICC40365）;5-羥甲基糠醛、糠醛等試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備

氣浴恒穩(wěn)振蕩器722S，上海精密科學(xué)儀器有限公司;紫外分光光度計(jì)UV762，上海精密科學(xué)儀器有限公司;電子分析天平FA1604，上海衡平儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 小麥麩皮酸解液的制備。

小麥麩皮經(jīng)粉碎并過60目篩后，于50 ℃烘箱烘干后室溫密閉保存。對(duì)上述處理后的小麥麩皮進(jìn)行酸解：硫酸濃度為1.5%，小麥麩皮67 g/L，100 ℃下酸解3 h。取出并自然降溫后過濾，濾液經(jīng)NaOH調(diào)節(jié)至pH中性，即為酸解液，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 糠醛、5-羥甲基糠醛含量的測(cè)定[11]。

準(zhǔn)確稱取1000 g糠醛和1.000 g 5-羥甲基糠醛，分別用95%乙醇溶解并稀釋至不同濃度梯度。采用紫外分光光度計(jì)分別在276和284 nm處測(cè)定糠醛和5-羥甲基糠醛吸光度（OD276和OD284），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。結(jié)果表明，糠醛濃度在0.10～10.00 mg/L、5-羥甲基糠醛濃度在1.00～18.00 mg/L與吸光度具有良好的線性關(guān)系，線性方程分別為

Y1=0.189 9X1-0016 3（R2=0.996 6）、Y2=0.123 6X2+0.024 9（R2=0.996 9），其中Y1、Y2為吸光度，X1、X2分別為糠醛、5-羥甲基糠醛的濃度。

制備得到的小麥麩皮酸解液在3 000 r/min下離心10 min，取上清液分別稀釋后采用分光光度法測(cè)定OD276和OD284，根據(jù)糠醛和5-羥甲基糠醛的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算出含量。

1.3.3 蘋果酸含量的測(cè)定。蘋果酸的檢測(cè)利用的是Goodban法[12]。準(zhǔn)確稱取蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶解并稀釋至不同濃度梯度，依次加入6.00 mL濃硫酸、0.10 mL 2，7-萘二酚溶液，于100 ℃的沸水中水浴20 min。反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)液并冷卻到室溫，采用分光光度法測(cè)定390 nm處吸光度，建立蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程。

結(jié)果表明蘋果酸濃度在10.00～80.00 mg/L與吸光度具有良好的線性關(guān)系，線性方程為

Y3=0.009 2X3+0.030 7（R2=0.997 9），其中Y3為吸光度，X3為蘋果酸濃度。

取樣品溶液1.00 mL（蘋果酸濃度控制在10.00～80.00 mg/L）依照上述方法測(cè)定OD390處吸光度，根據(jù)線性方程計(jì)算蘋果酸含量。

1.3.4 曲霉發(fā)酵產(chǎn)蘋果酸的培養(yǎng)基。

曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基：糖濃度100.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g、CaCl2·2H2O 0.1 g、KH2PO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4 0.5 g、（NH4）2SO4 2.0 g、CaCO3 70.0 g（單獨(dú)滅菌）。121 ℃下滅菌處理20 min。接種寄生曲霉，發(fā)酵培養(yǎng)120 h。

1.3.5 糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的影響。

在以葡萄糖為碳源的寄生曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的糠醛和5-羥甲基糠醛（表1），于恒溫?fù)u床中以200 r/min、30 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)120 h。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中蘋果酸含量。

1.3.6 活性炭對(duì)小麥麩皮酸解液的脫毒效果影響。

取酸解液100 mL，通過分別添加不同質(zhì)量活性炭（m/V）、處理溫度和處理時(shí)間，研究活性炭添加量、處理溫度和時(shí)間對(duì)酸解液中糠醛、5-羥基糠醛的脫除效果。

脫除率=（脫除后的質(zhì)量/脫除前的質(zhì)量）×100%。

1.3.7 小麥麩皮酸解液發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的可行性。

分別以葡萄糖、小麥麩皮酸解液和脫毒后的小麥麩皮酸解液為碳源，制備相同發(fā)酵培養(yǎng)基（發(fā)酵液中糖含量保持相同），在200 r/min 30 ℃發(fā)酵120 h，發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)蘋果酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥麩皮酸解液糠醛和5-羥甲基糠醛的含量測(cè)定

分別測(cè)定糠醛和5-羥甲基糠醛的吸光度后，帶入其線性方程，計(jì)算得到小麥麩皮酸解液中糠醛的濃度為（481.11±34.23）mg/L、5-羥甲基糠醛的濃度為（573.37±23.42）mg/L。這2種物質(zhì)的濃度均低于文獻(xiàn)記載的采用高壓反應(yīng)釜進(jìn)行稀酸酸解后的最大值[13]，可能是該試驗(yàn)使用的硫酸濃度較低和酸解溫度較低，產(chǎn)生的糠醛和5-羥甲基糠醛濃度也較低。

2.2 糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的影響

從圖1可以看出，糠醛和5-羥甲基糠醛含量對(duì)寄生曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸有明顯的抑制作用。抑制物添加量100 mg/L時(shí)，蘋果酸產(chǎn)量明顯降低，隨著發(fā)酵液中糠醛和5-羥甲基糠醛含量的增加，蘋果酸產(chǎn)量繼續(xù)降低，說明發(fā)酵液中糠醛和5-羥甲基糠醛含量越高，抑制作用越明顯，蘋果酸發(fā)酵產(chǎn)酸率越低。同時(shí)也可以看出糠醛對(duì)寄生曲霉發(fā)酵產(chǎn)生蘋果酸的抑制作用比5-羥甲基糠醛的抑制作用強(qiáng)烈。

2.3 小麥麩皮酸解液的脫毒條件優(yōu)化

2.3.1 活性炭添加量對(duì)酸解液脫毒效果的影響。

在小麥麩皮酸解液中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%（m/V）活性炭，在25 ℃下攪拌30 min，分析活性炭添加量對(duì)小麥麩皮酸解液脫除效果的影響，結(jié)果見圖2。

活性炭的比表面積和微孔容積高，容易吸附小分子量有機(jī)物，是一種常用的吸附脫除方法。由圖2可知，添加活性炭后，酸解液中的糠醛與5-羥甲基糠醛脫除率迅速增大，說明活性炭的添加量對(duì)糠醛與5-羥甲基糠醛脫除影響顯著，也表明活性炭對(duì)糠醛與5-羥甲基糠醛具有較好的吸附能力。當(dāng)活性炭含量超過1.0%時(shí)，糠醛的脫除率上升緩慢，最大脫除率為57.47%，5-羥甲基糠醛的曲線無明顯變化，最大脫除率為54.70%?；钚蕴刻砑恿吭龃罂梢蕴岣咚峤庖褐幸种莆锏拿摮?，但總糖含量損失較大[14]，因此該試驗(yàn)選定活性炭濃度1.5%為最佳添加量。

2.3.2 處理時(shí)間對(duì)酸解液脫毒效果的影響。

小麥麩皮酸解液中活性炭添加量為1.5%（m/V），在25 ℃下攪拌10、20、30、40、50、60 min，分析活性炭不同處理時(shí)間對(duì)小麥麩皮酸解液脫除效果的影響，結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，處理時(shí)間對(duì)活性炭脫除糠醛、5-羥甲基糠醛的脫除效果有明顯影響。在10 min內(nèi)，活性炭對(duì)糠醛和5-羥甲基糠醛的脫除率迅速上升，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而繼續(xù)提高;超過40 min后，脫除率增加不明顯，說明此時(shí)的活性炭吸附能力已飽和?；钚蕴繉?duì)糠醛的脫除率略高于5-羥甲基糠醛，可能是5-羥甲基糠醛的疏水性比糠醛弱，影響了脫除效果，使得與活性炭的吸附力比糠醛與活性炭的吸附力弱[14-15]。

2.3.3 溫度對(duì)酸解液脫毒效果的影響。

向小麥麩皮酸解液中添加活性炭含量1.5%，分別在20、30、40、50和60 ℃下攪拌40 min，分析不同溫度條件對(duì)小麥麩皮酸解液脫除效果的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，處理溫度對(duì)糠醛、5-甲基糠醛的脫除率趨勢(shì)基本相同，影響也比較明顯。在20～30 ℃時(shí)，脫除率明顯上升，超過40 ℃后，脫除率呈下降趨勢(shì)，可能是較高的溫度破壞了活性炭與糠醛等物質(zhì)的吸附作用力，降低了活性炭的吸附性質(zhì)。

根據(jù)上述結(jié)果可知，小麥麩皮酸解液的脫毒最佳條件為活性炭添加量1.5%（m/V）、處理溫度30 ℃、處理時(shí)間40 min。在此條件下進(jìn)行脫毒處理后，檢測(cè)得到糠醛含量173.93 mg/L，脫除率為63.87%;5-羥甲基糠醛含量為220.8 mg/L，脫除率達(dá)61.49%。

2.4 脫毒后小麥麩皮酸解液發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的可行性

研究曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸耐受性發(fā)現(xiàn)，當(dāng)糠醛和5-羥甲基糠醛含量低于200 mg/mL時(shí)，曲霉仍能進(jìn)行發(fā)酵。分別以葡萄糖、小麥麩皮酸解液和最佳條件下脫毒后的小麥麩皮酸解液為碳源，發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸，分析小麥麩皮酸解液脫毒處理后發(fā)酵產(chǎn)蘋果酸的可行性，結(jié)果見圖5。

47卷11期郭 娜等 小麥麩皮酸解液脫毒發(fā)酵制備蘋果酸的可行性

由圖5可知，以葡萄糖、小麥麩皮酸解液和脫毒后的小麥麩皮酸解液為碳源發(fā)酵制備蘋果酸的產(chǎn)酸量分別是2543、8.32、15.56 g/L。小麥麩皮酸解液脫毒后發(fā)酵產(chǎn)蘋果酸的量相對(duì)于未脫毒前的產(chǎn)酸量明顯增高，說明小麥麩皮酸解液經(jīng)活性炭吸附脫毒后可以用于發(fā)酵產(chǎn)蘋果酸。

3 結(jié)論與討論

糠醛與5-羥甲基糠醛對(duì)寄生曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸有明顯的抑制作用，糠醛與5-羥甲基糠醛的含量越高，對(duì)蘋果酸發(fā)酵的抑制作用越顯著。使用活性炭對(duì)小麥麩皮酸解液進(jìn)行脫毒處理，最適條件為活性炭含量1.5%、處理溫度30 ℃、時(shí)間40 min;在此條件下，小麥麩皮酸解液中的糠醛與5-羥甲基糠醛的脫除率分別達(dá)63.87%和61.49%。酸解液中糠醛與5-羥甲基糠醛含量下降至200 mg/L左右，顯著降低了這2種抑制物對(duì)小麥麩皮酸解液發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的抑制作用。經(jīng)活性炭處理后的小麥麩皮酸解液作為碳源進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸是可行的。

隨著市場(chǎng)對(duì)L-蘋果酸的需求量日益增大，采用非糧資源如小麥麩皮和玉米秸稈等，通過糖化和脫毒處理降低抑制物含量，基因技術(shù)選育纖維素水解物耐受性菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸是一條經(jīng)濟(jì)可行和可持續(xù)發(fā)展的途徑[16]。

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