郭相伸 ，溫書恒 ，董雯雯 ，李炳譞 ，陳子原 ，王林林 ，官大威 ，趙銳

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)司法鑒定中心，遼寧 沈陽 110122；2.智慧檢務(wù)創(chuàng)新研究院 智慧司法鑒定聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110122；3.中國刑事警察學(xué)院，遼寧 沈陽 110035）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是法醫(yī)病理學(xué)鑒定中常見的死亡原因，腦損傷時(shí)間的推斷是法醫(yī)病理學(xué)研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)[1-2]，其準(zhǔn)確推斷不僅有助于縮小案件偵查范圍，還可幫助確定案件性質(zhì)。傳統(tǒng)的損傷時(shí)間推斷，主要是依據(jù)肉眼和光學(xué)顯微鏡觀察腦損傷后組織病理學(xué)改變，但其受到損傷程度、損傷部位和個(gè)體因素等諸多因素的影響，而且損傷后形態(tài)學(xué)變化的時(shí)間窗口相對(duì)寬、缺乏明確的時(shí)間界限，甚至缺乏特征性的形態(tài)學(xué)改變，所以很難準(zhǔn)確推斷腦損傷后的經(jīng)過時(shí)間。隨著醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，法醫(yī)病理學(xué)者開始在腦損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)檢測(cè)多種生物標(biāo)志物（蛋白、細(xì)胞因子、炎癥因子）總體蛋白或基因水平的表達(dá)變化，探討其與損傷經(jīng)過時(shí)間的相關(guān)性[3-4]。有研究[5]利用人腦損傷后神經(jīng)元的凋亡情況對(duì)腦損傷時(shí)間進(jìn)行推斷，有利用單鏈DNA作為人腦神經(jīng)元損傷的免疫組織化學(xué)標(biāo)記物[6]，也有對(duì)血清中各種標(biāo)記物進(jìn)行研究，以判斷腦損傷后血清各指標(biāo)的變化情況[7]。

核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid derived 2-related factors，Nrf2）是細(xì)胞抗氧化防御體系的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，屬于CNC堿性亮氨酸拉鏈蛋白（cap’n’collar basic leucine zipper，CNC-bZIP）家族成員，在腦損傷后的抗氧化和抗炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目前，研究腦損傷時(shí)間主要針對(duì)損傷腦組織進(jìn)行單一因子的蛋白或基因表達(dá)水平的檢驗(yàn)，且局限于動(dòng)物模型的研究。本研究針對(duì)人體腦損傷組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫熒光雙染色技術(shù)，檢測(cè)Nrf2在人腦損傷后不同細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，并探討其與損傷時(shí)間的相關(guān)性，以期為推斷腦損傷經(jīng)過時(shí)間提供新的方法和參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

36例人腦組織均來自中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)司法鑒定中心在2013—2018年間鑒定受理的案件，該研究根據(jù)1964年的赫爾辛基宣言進(jìn)行，并得到了中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有詳細(xì)的案情調(diào)查資料；（2）明確的頭部外傷史；（3）準(zhǔn)確的顱腦損傷時(shí)間和死亡時(shí)間；（4）死后冷藏48h內(nèi)或冷凍7d內(nèi)進(jìn)行檢材提取。按照案情提供的損傷后經(jīng)過時(shí)間將入選案例分為對(duì)照組，傷后0～1h、傷后3～6h、傷后1～3 d、傷后5～7 d、傷后10～14 d組。每組6例。對(duì)照組6例為心臟性猝死無腦外傷的個(gè)體，30例腦挫傷個(gè)體中損傷原因包括交通事故16例、鈍器傷12例、墜落傷2例。

1.2 方法

1.2.1 取材及制片

將取材組織在4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定48h后，以皮質(zhì)挫傷區(qū)為中心取材，大小為1.5cm×1.5cm×0.5cm，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，連續(xù)切片（厚5μm）。

1.2.2 蘇木素-伊紅染色

常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，中性樹膠封片。

1.2.3 雙重免疫熒光染色

切片經(jīng)脫蠟、水化后，非免疫血清封閉2 h，加入磷酸緩沖液稀釋、兔抗人Nrf2抗體（1∶500，ab62352，英國Abcam公司），小鼠抗人神經(jīng)核（1∶100，neuronal nuclei，NeuN）抗體（MAB377，德國Merck公司）、小鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（1∶400，60190-1-ig，美國Proteintech公司）、小鼠抗人離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，IBA1）抗體（1∶400，MABN92，德國Merck公司）4℃過夜。次日用磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein is othiocyanate，F(xiàn)ITC）-驢抗小鼠IgG（H+L）、CY5-驢抗兔 IgG（H+L）熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，充分水洗，并用含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的抗熒光淬滅劑封片。

1.2.4 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分析

在每張免疫染色的切片中，在腦皮質(zhì)損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)使用相同的放大倍數(shù)（物鏡40倍）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察神經(jīng)元（NeuN陽性）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP陽性）、小膠質(zhì)細(xì)胞（IBA1陽性）的細(xì)胞數(shù)，分別計(jì)數(shù)以上細(xì)胞和Nrf2共同陽性的細(xì)胞數(shù)目，應(yīng)用Image J 1.49v（美國Wayne Rasband開發(fā)）圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)不同陽性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，應(yīng)用同一分組內(nèi)的不同數(shù)據(jù)計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

36例入組年齡在19～68歲，男性23名，女性13名。經(jīng)案情調(diào)查的損傷后經(jīng)過時(shí)間為5min～14d。

2.2 組織病理學(xué)改變

正常腦組織皮質(zhì)神經(jīng)元尼氏體邊聚，核仁清晰。腦挫傷后1h內(nèi)見皮質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，散在灶性出血，皮質(zhì)內(nèi)小血管收縮；傷后3～6 h，損傷區(qū)神經(jīng)元變性，呈梭形或圓形，周邊區(qū)神經(jīng)元嗜伊紅染色增強(qiáng)；傷后1～3d，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)紅染，神經(jīng)元數(shù)量減少；傷后5～7d，損傷區(qū)神經(jīng)元壞死，膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大；傷后10～14 d，出血被吸收，散在含鐵血黃素樣物，挫傷區(qū)腦軟化，可見格子細(xì)胞伴散在小圓細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷周邊區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞嗜伊紅染色增強(qiáng)（圖1）。

2.3 Nrf2在腦挫傷后損傷周邊區(qū)NeuN陽性神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)

在正常腦組織中，NeuN陽性神經(jīng)元內(nèi)未見明顯的Nrf2表達(dá)。腦挫傷后，損傷區(qū)NeuN陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量從傷后3～6 h開始減少，1～3 d后NeuN陽性細(xì)胞數(shù)目基本穩(wěn)定（圖2）。由表1可見，Nrf2陽性神經(jīng)元數(shù)量從傷后1h開始增加，傷后1～3d達(dá)到高峰（P＜0.05），以后逐漸下降。Nrf2陽性神經(jīng)元占總體神經(jīng)元的比例在傷后1～3 d達(dá)到高峰（P＜0.05），此后逐漸下降。

圖1 腦皮質(zhì)挫傷后組織病理學(xué)改變（HE×400）

圖2 腦皮質(zhì)挫傷后Nrf2和NeuN免疫熒光雙重染色

2.4 Nrf2在腦挫傷后損傷周邊區(qū)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

表1 TBI后不同時(shí)間段挫傷區(qū)腦皮質(zhì)中NeuN陽性細(xì)胞與Nrf2陽性細(xì)胞數(shù)及比例

GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2在正常腦組織微弱表達(dá)。腦挫傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞于傷后1～3d被激活，GFAP陽性強(qiáng)度增加，陽性細(xì)胞胞體肥大，突起明顯、粗大、不規(guī)則（圖3）。由表2可見，GFAP及Nrf2陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量從傷后1～3d開始增加，傷后5～7d達(dá)到高峰（P＜0.05），以后逐漸下降，傷后14 d仍存在較高表達(dá)的GFAP陽性及Nrf2陽性細(xì)胞。Nrf2陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞占星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例在傷后相對(duì)穩(wěn)定。

表2 TBI后不同時(shí)間段挫傷區(qū)腦皮質(zhì)中GFAP陽性細(xì)胞與Nrf2陽性細(xì)胞數(shù)及比例

2.5 Nrf2在腦挫傷后損傷周邊區(qū)IBA1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

在正常腦組織中，IBA1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2微弱表達(dá)。腦挫傷后1h開始，IBA1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，胞體肥大，突起粗大，呈變形蟲樣形態(tài)（圖4）。由表3可見，IBA1及Nrf2雙陽性細(xì)胞數(shù)量從傷后1～3d開始增加，傷后5～7d IBA1陽性細(xì)胞達(dá)到高峰（P＜0.05），此后逐漸下降，Nrf2陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞占小膠質(zhì)細(xì)胞的比例在傷后5～7 d達(dá)到高峰（P＜0.05），以后逐漸下降。

圖4 腦皮質(zhì)挫傷后Nrf2和IBA1免疫熒光染色

表3 TBI后不同時(shí)間段挫傷區(qū)腦皮質(zhì)中IBA1陽性細(xì)胞與Nrf2的陽性細(xì)胞數(shù)及比例

3 討 論

氧化應(yīng)激損傷是顱腦損傷的重要機(jī)制之一[8]。Nrf2是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子，也是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子，通過誘導(dǎo)調(diào)控一系列細(xì)胞抗氧化蛋白的表達(dá)，減輕活性氧和親電體引起的細(xì)胞損傷，使細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，維持機(jī)體氧化還原動(dòng)態(tài)平衡。大量[9-10]研究表明，Nrf2在腦損傷后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，不僅通過上調(diào)抗氧化酶發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，還通過抗細(xì)胞凋亡、抗炎及參與自噬和泛素化蛋白降解發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)性作用。前期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究[11-12]結(jié)果已經(jīng)表明，Nrf2蛋白和mRMA水平在損傷側(cè)的腦皮質(zhì)和海馬存在時(shí)間依賴性表達(dá)。本研究針對(duì)人腦挫傷組織，結(jié)合形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用熒光雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)Nrf2在損傷區(qū)和損傷周邊區(qū)不同細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，并探討其與損傷時(shí)間的相關(guān)性，探討其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中推斷腦損傷時(shí)間的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，Nrf2在損傷后腦內(nèi)不同細(xì)胞的表達(dá)差異，有利于闡述Nrf2在損傷后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制并為臨床上以Nrf2為靶點(diǎn)治療腦損傷提供理論依據(jù)。

研究結(jié)果[13]表明，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元更容易受到氧化性損傷，主要是由于其內(nèi)在抗氧化能力較弱，其抗氧化能力一方面依賴于周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞[14]，另一方面通過獲取周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞提供的抗氧化底物來實(shí)現(xiàn)自身的抗氧化活性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后神經(jīng)元內(nèi)Nrf2在損傷后1d表達(dá)Nrf2的陽性細(xì)胞達(dá)到高峰，這種快速表達(dá)可能與損傷后大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成有關(guān)。盡管損傷后神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)Nrf2，但其細(xì)胞抗氧化能力有限，可能與上調(diào)的Nrf2主要存在于神經(jīng)元胞漿內(nèi)，并未發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦皮質(zhì)維持生理穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵細(xì)胞，其作用包括支持神經(jīng)元、維護(hù)血腦屏障完整性、參與炎癥反應(yīng)、構(gòu)建膠質(zhì)瘢痕等[14，16]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果[15]表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞中存在高水平Nrf2的表達(dá)，這可能與其維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)氧化還原平衡有關(guān)，主要是通過提供釋放谷胱甘肽的前體，保證谷胱甘肽的生物合成。本研究發(fā)現(xiàn)，正常腦皮質(zhì)GFAP陽性細(xì)胞內(nèi)存在微弱的Nrf2著色，損傷后GFAP陽性細(xì)胞逐漸增多，在傷后7d達(dá)到高峰，而且Nrf2在GFAP陽性細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)也隨傷后時(shí)間的延長(zhǎng)輕度增高，維持在相對(duì)穩(wěn)定的比例。盡管大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存在Nrf2的陽性著色，但其強(qiáng)度并非很高，提示內(nèi)源性星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生Nrf2的能力不足，這也解釋了損傷后大量神經(jīng)元死亡的原因。考慮到星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的支持作用及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)作用，以星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2為靶點(diǎn)可能是治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的潛在靶點(diǎn)。

神經(jīng)炎癥是繼發(fā)性顱腦損傷的重要機(jī)制之一，創(chuàng)傷性腦損傷介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，涉及小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及外周來源的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和T細(xì)胞[14]。創(chuàng)傷性腦損傷后，腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變成激活狀態(tài)，分泌炎癥因子并吞噬清除壞死崩解的腦組織碎片[17]。研究[9，18]結(jié)果表明，Nrf2缺失的小鼠在顱腦損傷后出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，而Nrf2的過表達(dá)則有效減低損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，提示Nrf2在顱腦損傷后發(fā)揮了重要的抗炎作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2微弱表達(dá)，損傷后出現(xiàn)大量IBA1陽性細(xì)胞活化，提示Nrf2參與損傷后的炎癥調(diào)控，并且大部分活化的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Nrf2，其陽性細(xì)胞比例在傷后5～7d達(dá)到高峰，之后開始下降。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，應(yīng)用免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)Nrf2在腦皮質(zhì)挫傷區(qū)及周邊區(qū)不同細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，輔助推斷腦損傷的時(shí)間，有望為人體顱腦損傷時(shí)間的推斷提供新的指標(biāo)。作為腦損傷時(shí)間推斷的理想分子標(biāo)記物應(yīng)該具有以下特點(diǎn)：（1）在正常腦組織存在但不表達(dá)或表達(dá)水平很低；（2）當(dāng)挫傷發(fā)生時(shí)，各種內(nèi)外因素的刺激促進(jìn)其表達(dá)，抵抗外來損傷并參與機(jī)體損傷修復(fù)；（3）標(biāo)記物的表達(dá)隨損傷后經(jīng)過時(shí)間呈現(xiàn)規(guī)律性變化。

目前，基于實(shí)驗(yàn)研究，有望用于推斷顱腦損傷經(jīng)過時(shí)間的指標(biāo)主要包括熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、Homer蛋白、P35/25蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、S100蛋白、髓磷脂堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神經(jīng)絲蛋白（neurofilament protein，NFP）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、泛素羧基末端水解酶L1（ubiquitin carboxy terminal hydrolases-L1，UCH-L1）等，以及核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-6、IL-8、IL-1β等細(xì)胞因子，但應(yīng)用單一指標(biāo)進(jìn)行腦挫傷時(shí)間推斷往往不能準(zhǔn)確判定[19]。本研究基于不同細(xì)胞內(nèi)單一標(biāo)記物Nrf2的表達(dá)變化，提出單一標(biāo)記物在不同細(xì)胞類型的表達(dá)變化有望用于相對(duì)準(zhǔn)確的腦損傷時(shí)間推斷的研究思路。研究結(jié)果表明：Nrf2陽性細(xì)胞數(shù)在神經(jīng)元內(nèi)，于傷后1 d達(dá)到高峰；在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，于傷后7d達(dá)到高峰。根據(jù)Nrf2在這三類細(xì)胞中表達(dá)量的改變，有助于早期腦損傷的時(shí)間推斷。但隨著蛋白組學(xué)、基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，以及應(yīng)用多指標(biāo)綜合分析判斷結(jié)合人工智能的算法等技術(shù)的發(fā)展，在未來這些技術(shù)有望為顱腦損傷時(shí)間推斷開辟一條新的思路。