朱建翠，何日文，沈 丹，張海冰，陳裕華，王 令，楊建宇，鄒夢(mèng)佳，陳 裕，鐘卓玲

（廣州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東廣州 510440）

禽流感是指由禽流感病毒引起的一種禽類(lèi)傳染病，可以引起禽類(lèi)呼吸器官或全身性感染。根據(jù)病毒的外膜血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，禽流感病毒可分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型。2013年3月，上海、安徽首次報(bào)導(dǎo)3例人感染H7N9流感病例。研究發(fā)現(xiàn)，活禽市場(chǎng)是禽流感病毒的重要儲(chǔ)存庫(kù)[1]，也被認(rèn)為是人感染H5N1、H7N9等禽源流感的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域[2-3]。而家禽批發(fā)市場(chǎng)由于聚集了大量不同種屬、不同產(chǎn)地、不同健康狀況的活禽，因而為禽流感病毒的重組和跨種傳播提供了有利條件[4]。為掌握廣州市家禽批發(fā)市場(chǎng)中的家禽禽流感病毒攜帶狀況和市場(chǎng)環(huán)境中的禽流感病毒污染情況，2013年以來(lái)，廣州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所制定監(jiān)測(cè)計(jì)劃，持續(xù)對(duì)轄區(qū)內(nèi)家禽批發(fā)市場(chǎng)進(jìn)行禽流感監(jiān)測(cè)。本文對(duì)2013—2018年廣州市某家禽批發(fā)市場(chǎng)的禽流感監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析，以期為了解廣州市家禽批發(fā)市場(chǎng)的禽流感流行特點(diǎn)，預(yù)警疫病流行趨勢(shì)，進(jìn)一步加強(qiáng)禽流感防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據(jù)年度動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃，每月1次，在廣州市白云區(qū)某家禽批發(fā)市場(chǎng)隨機(jī)抽取雞、鴨、鵝、鴿售賣(mài)檔口若干，隨機(jī)抽取檔口內(nèi)禽只及環(huán)境樣品。每只家禽采集咽喉、泄殖腔棉拭子各1份，同一檔口每5只家禽的棉拭子放入1個(gè)內(nèi)含5 mL PBS液的10 mL離心管中；同時(shí)采集該檔口的環(huán)境棉拭子樣品（地面、圍欄、污水、籠具、推車(chē)等），同一檔口每3份環(huán)境棉拭子樣品放入1個(gè)離心管中，低溫保存送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

每次采集的檔口數(shù)量和樣品數(shù)量依據(jù)監(jiān)測(cè)計(jì)劃和工作需求略有不同。

1.2 儀器與試劑

全自動(dòng)核酸提取儀：美國(guó)Thermo公司；7500實(shí)時(shí)定量PCR儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；LC480熒光定量PCR儀：瑞士羅氏公司。兩臺(tái)PCR儀根據(jù)檢測(cè)工作安排隨機(jī)使用。

禽流感病毒通用型核酸實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司、中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司、深圳太太基因工程有限公司產(chǎn)品；H7亞型禽流感病毒核酸檢測(cè)試劑：中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司、北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司、廣州維伯鑫生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 檢測(cè)方法

標(biāo)本凍融后置于振蕩器充分混勻，按照美國(guó)應(yīng)用生物有限公司AM1836-5 病毒核酸抽取試劑盒說(shuō)明書(shū)和美國(guó)Thermo Scientific KingFisher Flex全自動(dòng)磁珠提取純化系統(tǒng)的操作方法，提取病毒RNA；按照禽流感通用型實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)通用型核酸陽(yáng)性樣品，進(jìn)一步作H7亞型流感病毒核酸檢測(cè)。

1.4 陽(yáng)性群體/個(gè)體定義

將1個(gè)活禽批發(fā)檔口作為1個(gè)統(tǒng)計(jì)禽群。該檔口采集的家禽咽喉/泄殖腔棉拭子或環(huán)境棉拭子中，至少有1份呈禽流感病毒核酸陽(yáng)性，定義為群體陽(yáng)性。

每份禽流感病毒核酸陽(yáng)性棉拭子樣品，定義為個(gè)體陽(yáng)性。

1.5 結(jié)果分析

通過(guò)Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，通過(guò)SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 禽流感病毒通用型核酸監(jiān)測(cè)情況

2.1.1 不同年份 2013—2018年，共在該批發(fā)市場(chǎng)的254個(gè)（次）活禽售賣(mài)檔口采集樣品，檢出通用型禽流感陽(yáng)性125個(gè)，群陽(yáng)性率為49.21%（125/254），共采集家禽咽喉/泄殖腔棉拭子和環(huán)境棉拭子樣品3 611份，檢出通用型陽(yáng)性1 248份，個(gè)體陽(yáng)性率為34.56%（1 248/3 611）。各年度陽(yáng)性率處于波動(dòng)狀下降態(tài)勢(shì)，2014年大幅度下降，之后逐步升高，2017年又大幅下降（表1）。

表1 2013—2018年某家禽批發(fā)市場(chǎng)禽流感病毒通用型核酸陽(yáng)性結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.1.2 不同季節(jié) 將2013—2018年的個(gè)體陽(yáng)性率按季度統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)一季度的陽(yáng)性率總體高于其他季度，而其他季度中，有4個(gè)季度未監(jiān)測(cè)到陽(yáng)性（圖1）。

圖1 2013—2018年各季度禽流感病毒通用型核酸個(gè)體陽(yáng)性率比較

2.1.3 不同樣品 將2013—2018年的3 045份活禽棉拭子樣品（雞、鴨、鵝、鴿）與551份環(huán)境棉拭子樣品進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)環(huán)境棉拭子樣品陽(yáng)性率（26.86%）低于禽棉拭子（35.63%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。2015、2018年的環(huán)境樣品陽(yáng)性率明顯低于活禽樣品（P＜0.01），其余年份二者的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 不同樣品禽流感病毒通用型核酸陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果比較

2.1.4 不同家禽品種 2013—2018年，在該市場(chǎng)共采集雞棉拭子1 645份、鴨棉拭子570份、鵝棉拭子540份、鴿棉拭子290份，個(gè)體陽(yáng)性率從高到低依次為鵝、鴨、雞、鴿（圖2）。以雞棉拭子陽(yáng)性率為參考，用風(fēng)險(xiǎn)比計(jì)算公式：風(fēng)險(xiǎn)比（RR）=不同家禽棉拭子陽(yáng)性率/雞棉拭子陽(yáng)性率，分別計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比，發(fā)現(xiàn)鴿攜帶禽流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)是雞的0.75倍（P=0.01），鵝攜帶禽流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)是雞的2.04倍（P＜0.01），鴨攜帶禽流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)是雞的1.61倍（P＜0.01）。

2.1.5 不同品種家禽售賣(mài)檔口 對(duì)2013—2018年不同品種家禽售賣(mài)檔口的環(huán)境棉拭子陽(yáng)性率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)鴨售賣(mài)檔口的環(huán)境陽(yáng)性率最高（47.47%），其次是鵝售賣(mài)檔口（27.84%），雞售賣(mài)檔口最低（16.73%），與對(duì)應(yīng)家禽的個(gè)體陽(yáng)性率分布不太一致（圖3）。

圖2 不同家禽品種個(gè)體陽(yáng)性率比較

圖3 不同品種家禽售賣(mài)檔口環(huán)境禽流感病毒通用型核酸陽(yáng)性率比較

2.2 H7亞型流感病毒核酸監(jiān)測(cè)情況

對(duì)通用型禽流感核酸陽(yáng)性樣品進(jìn)一步作H7亞型流感病毒核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示，該市場(chǎng)2015年開(kāi)始檢測(cè)到陽(yáng)性，2016—2017年陽(yáng)性率達(dá)到高峰，而2018年未檢出陽(yáng)性。陽(yáng)性樣品均為雞棉拭子和環(huán)境棉拭子（圖4）。

圖4 2013—2018年H7亞型流感病毒核酸監(jiān)測(cè)情況

3 討論

本研究對(duì)廣州市交易量最大的某家禽批發(fā)市場(chǎng)2013—2018年的禽流感病原監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該市場(chǎng)近年來(lái)的禽流感病毒通用型核酸陽(yáng)性率呈波動(dòng)狀下降趨勢(shì)。據(jù)林鴻等[5]研究，廣州市家禽批發(fā)市場(chǎng)交易的活禽90%以上來(lái)自廣東、廣西兩地，而該兩地分別于2013年（H5N1亞型Re-6株）、2016年（Re-6株+ Re-8株）、2017年（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）更換家禽禽流感強(qiáng)制免疫疫苗毒株。不難發(fā)現(xiàn)，更換強(qiáng)制免疫疫苗毒株后的下一年（即2014、2017、2018年），批發(fā)市場(chǎng)的禽流感病毒載量均出現(xiàn)明顯下降，說(shuō)明及時(shí)更換與流行毒株相匹配的禽流感免疫疫苗，可有效防控交易市場(chǎng)的禽流感。

從季節(jié)分布來(lái)看，一季度的禽流感病毒核酸陽(yáng)性率明顯高于其他季度，這可能與廣東省一季度既潮濕又寒冷，有利于病毒存活有關(guān)。但是二、三季度的陽(yáng)性率也處于20%～30%之間的較高水平，說(shuō)明季節(jié)差異縮小。因此，除了冬春季節(jié)要加強(qiáng)防控外，夏秋季也不可掉以輕心。從品種分布來(lái)看，各年度家禽樣品陽(yáng)性率與環(huán)境樣品陽(yáng)性率差異不大，但各品種家禽之間差異較大，水禽仍然是主要帶毒品種，這與張海冰等[6]的研究結(jié)論一致。不同品種家禽售賣(mài)檔口的環(huán)境棉拭子與對(duì)應(yīng)家禽的棉拭子陽(yáng)性率并不完全一致，但鴨、鵝陽(yáng)性率及其售賣(mài)檔口的環(huán)境陽(yáng)性率都較高，說(shuō)明應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)加強(qiáng)鴨、鵝的市場(chǎng)防疫監(jiān)管，督促落實(shí)清洗消毒。

2017年7月開(kāi)始，我國(guó)在家禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)推廣使用禽流感（H5+H7）二價(jià)苗，2018年該市場(chǎng)中沒(méi)有檢出H7亞型流感，廣州市也無(wú)人H7N9流感感染病例，說(shuō)明家禽免疫對(duì)于迅速減少市場(chǎng)中H7亞型流感病毒載量，阻斷“禽—市場(chǎng)—人”的傳播起到了良好作用。

本研究在時(shí)間分布上僅從年度和季度進(jìn)行了簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)分析比較，也未對(duì)各年份該批發(fā)市場(chǎng)禽流感防控政策調(diào)整、休市頻率及持續(xù)時(shí)間等對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果的影響做進(jìn)一步分析。下一步有必要將監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)細(xì)化，分析導(dǎo)致監(jiān)測(cè)結(jié)果變化的可能因素，為切實(shí)了解本地區(qū)活禽批發(fā)市場(chǎng)的禽流感流行趨勢(shì)和采取有針對(duì)性的防控措施提供依據(jù)。