吳志賢 李響 莫自增

[摘要]目的：探討異澤蘭黃素（Eupatilin）介導(dǎo)PDGFβ對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖抑制作用的分子機(jī)制。方法：應(yīng)用組織貼壁法從增生性瘢痕和正常皮膚組織中分離增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞，Western blot法檢測PDGFβ在增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PDGFβ構(gòu)建PDGFβ過表達(dá)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，CCK8法檢測過表達(dá)PDGFβ對異澤蘭黃素抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力的影響，流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)PDGFβ對異澤蘭黃素促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的影響，Western blot法檢測過表達(dá)PDGFβ對異澤蘭黃素調(diào)控細(xì)胞內(nèi)p-ERK、Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：免疫組化和Western blot結(jié)果表明，與正常皮膚組織和成纖維細(xì)胞比較，增生性瘢痕組織和成纖維細(xì)胞中PDGFβ高表達(dá);CCK8結(jié)果顯示，與空載對照組（pcDNA31-control）比較，PDGFβ過表達(dá)組瘢痕成纖維細(xì)胞活力顯著升高（P<0.05）;流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與對照組pcDNA3.1-control+Eupatilin比較，pcDNA3.1-PDGFβ+Eupatilin組增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05）;Western blot結(jié)果顯示，PDGFβ過表達(dá)能顯著促進(jìn)p-ERK和Bcl2的表達(dá)增加，抑制Bax蛋白表達(dá)（P<0.05），與對照組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：異澤蘭黃素可抑制增生性瘢痕PDGFβ蛋白的表達(dá)，通過抑制PDGFβ/ERK通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]異澤蘭黃素;增生性瘢痕;細(xì)胞凋亡;PDGFβ;ERK通路

[中圖分類號]R619+.6 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2019）07-0044-04

Eupatilin Inhibits Hypertrophic Scar Proliferation Via the PDGFβ/ERK Signaling Pathway

WU Zhi-xian， LI Xiang，MO Zi-zeng，LIANG Jie

（Department of Plastic Surgery，Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，Guangdong，China）

Abstract： Objective ?To investigate the molecular mechanism of Eupatilin-mediated PDGFβ inhibiting the proliferation of hypertrophic scar fibroblasts. Methods ?The hypertrophic scars and normal skin fibroblasts were separated from hypertrophic scars and normal skin tissue by tissue adherence. The expression of PDGFβ in hypertrophic scars and normal skin fibroblasts were examined by western blot. The effect of PDGFβ on the viability of hypertrophic scar fibroblasts inhibited by Eupatilin was evaluated by CCK8 assay. The effect of PDGFβ on the apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts induced by Eupatilin was measured by flow cytometry analysis. The effect of PDGFβ on the expression of ERK， p-ERK， Bcl2 and Bax were examined by western blot analysis. Results ? Immunohistochemistry and western blot results showed that PDGFβ was highly expressed in hypertrophic scar tissue and fibroblasts compared with normal skin tissue and fibroblasts. CCK8 results showed that the activity of scar fibroblasts in the PDGFβ overexpression group was significantly higher compared with the empty control group （pcDNA31-control） （P<0.05）. Flow cytometry results showed that the apoptosis rate of the hypertrophic scar fibroblasts in the pcDNA3.1-PDGFβ+Eupatilin group was significantly lower compared with the control group pcDNA3.1-control+Eupatilin （P<0.05）. Western blot results showed that overexpression of PDGFβ significantly promoted the expression of p-ERK and Bcl2 and inhibited the expression of Bax protein， which was significantly different from the control group （P<0.05）. Conclusion ?Eupatilin inhibits the expression of PDGFβ protein in hypertrophic scars and induces apoptosis by inhibiting PDGFβ/ERK pathway.

Key words： eupatilin; hypertrophic scar; apoptosis; PDGFβ; ERK signaling pathway

正常皮膚損傷后，創(chuàng)傷后組織修復(fù)異常導(dǎo)致增生性瘢痕的產(chǎn)生。增生性瘢痕不僅伴有瘙癢等并發(fā)癥，而且嚴(yán)重影響美觀，給患者帶來巨大壓力。增生性瘢痕主要表現(xiàn)為多種纖維化因子的過度表達(dá)，膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)過度合成和降解減少[1]。由于增生性瘢痕發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，對該病的有效預(yù)防和治療一直是整形外科迫于解決的難題。闡明增生性瘢痕的分子發(fā)病機(jī)理，針對其發(fā)病的特異性環(huán)節(jié)研究和開發(fā)治療增生性瘢痕的新藥已經(jīng)迫切需要[2]。

異澤蘭黃素（Eupatilin）分子式為C18H16O7，是中藥艾葉里面發(fā)現(xiàn)的一種重要的黃酮類活性成分[3]。本課題前期研究表明異澤蘭黃素對瘢痕成纖維細(xì)胞有抑制作用，但具體分子機(jī)制還不清楚[4]。本研究探討PDGFβ和ERK通路在異澤蘭黃素促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡中的作用，進(jìn)一步闡明其抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生長的分子機(jī)制，為增生性瘢痕的治療提供臨床應(yīng)用依據(jù)。

1 ?材料和方法

1.1 試驗(yàn)試劑和儀器：異澤蘭黃素（美國sigma公司）;pcDNA3.1-PDGFβ及對照載體（上海吉凱基因）;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）;ERK、p-ERK、PDGFβ抗體（美國CST公司）;HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、CCK8試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)）;SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物）;流式細(xì)胞儀（FACSCantoⅡ，美國BD）;多功能凝膠成像系統(tǒng)、多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試驗(yàn)材料：標(biāo)本均取自于2017年廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科門診及住院患者手術(shù)切下的增生性瘢痕組織及正常的皮膚組織，增生性瘢痕及正常的皮膚組織臨床標(biāo)本各7例，患者年齡20～46歲，平均年齡29歲，其中男4例，女3例，4例來源于耳廓瘢痕，3例來源于背部、胸部等軀干部位瘢痕。所有患者均無其他全身器質(zhì)性病變，在手術(shù)切除前未接受過其他治療。所有標(biāo)本均根據(jù)臨床和病理（ HE染色切片的組織學(xué)檢查） 診斷證實(shí)。標(biāo)本取材經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會的論證許可，并得到患者知情同意。

1.3 方法

1.3.1 成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)：采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，操作如下：手術(shù)切除增生性瘢痕組織和正常皮膚組織（無菌操作），切成1mm×1mm，分散置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，添加RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，待成纖維細(xì)胞長出并融合成片時進(jìn)行傳代，即為增生性瘢痕成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)用傳至3～6代的成纖維細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將原代分離的人正常皮膚成纖維細(xì)胞和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞單層接種在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，常規(guī)換液、當(dāng)細(xì)胞密度匯合至90%～95%時，0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

用不含抗生素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)瘢痕成纖維細(xì)胞，按照Lipofectamine 2000操作說明按比例分別將Lipofectamine 2000和pcDNA3.1-PDGFβ（pcDNA3.1-control對照）混合后加入，6h后去除6孔板內(nèi)培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。37℃、5% CO2正常培養(yǎng)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.3.3 免疫組化染色檢測PDGFβ表達(dá)：取人增生性瘢痕組織和人正常皮膚組織的石蠟切片，常規(guī)脫蠟復(fù)水，按照免疫組化SABC試劑盒操作進(jìn)行染色，一抗為抗兔PDGFβ，加入DAB顯色后封片，于顯微鏡下鏡檢拍照。

1.3.4 CCK8檢測細(xì)胞增殖：取過表達(dá)PDGFβ的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，0.25%胰酶消化離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104個/ml，均以100μl/孔種植于96孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后加入不同終濃度（0、2.5、5、10、20、40μg/ml）的異澤蘭黃素，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入10μl CCK8溶液培養(yǎng)2h，于酶標(biāo)儀450nm下測定各孔吸光值（A450）。

1.3.5 流式檢測細(xì)胞凋亡：為了探索異澤蘭黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的影響與PDGFβ之間的關(guān)系，通過流式細(xì)胞儀檢測異澤蘭黃素對過表達(dá)PDGFβ的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的影響。取過表達(dá)PDGFβ的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（空載對照），0.25%胰酶消化離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104個/孔種植于6孔板，培養(yǎng)24h后加入終濃度為10μg/ml的異澤蘭黃素后培養(yǎng)24h。通過Annexin V-APC/7AAD雙染法檢測異澤蘭黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的影響，按照試劑盒操作說明書，以Buffer重懸細(xì)胞，加入APC標(biāo)記的工作液和7AAD標(biāo)記的工作液，冰上孵育15min后立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)：取過表達(dá)PDGFβ的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（空載對照），0.25%胰酶消化離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104個/孔種植于6孔板，培養(yǎng)24h后加入終濃度為10μg/ml的異澤蘭黃素后培養(yǎng)24h，PBS洗滌后加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清液即為蛋白樣品。使用BCA蛋白測定試劑盒對上清液的總蛋白進(jìn)行蛋白定量，從每個樣品中取總蛋白（30μg）加入電泳上樣緩沖液，100℃煮沸5min后于12% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入1：300稀釋的一抗，4℃孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次，每次5min，加入1：5 000稀釋的HRP標(biāo)記的II抗，室溫孵育1h，TBST洗膜6次，每次5min，加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，用ImageJ2x軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way-ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 PDGFβ在增生性瘢痕組織中高表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示，在正常皮膚組織中PDGFβ呈陰性表達(dá)，增生性瘢痕組織中PDGFβ呈陽性表達(dá)。見圖1。

2.2 PDGFβ在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中高表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示，與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中PDGFβ的蛋白表達(dá)顯著升高。見圖2。

2.3 異澤蘭黃素介導(dǎo)PDGFβ抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力：Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組（0μg/ml）相比，異澤蘭黃素5、10、20μg/ml組PDGFβ蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）（見圖3A）。CCK8結(jié)果顯示，異澤蘭黃素5、10、20μg/ml組與正常對照組（0μg/ml）相比，具有顯著性差異（P<0.05）。與空載對照組（pcDNA31-control）比較，PDGFβ過表達(dá)組瘢痕成纖維細(xì)胞活力顯著升高（P<0.05）（見圖3B）。

2.4 異澤蘭黃素介導(dǎo)PDGFβ促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡：流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與對照組pcDNA3.1-control+Eupatilin比較，pcDNA3.1-PDGFβ+Eupatilin組增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率顯著降低 （P<0.05）。見圖4。

2.5 異澤蘭黃素誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞PDGFβ/ERK通路的活化：免疫印跡檢測結(jié)果表明，異澤蘭黃素組PDGFβ、p-ERK和 Bcl2的蛋白水平顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高;與空載組比較，PDGFβ過表達(dá)組p-ERK和Bcl2的表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。見圖5。

3 ?討論

增生性瘢痕是皮膚創(chuàng)傷后引發(fā)的以成纖維細(xì)胞異常增殖并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)為主要特征的一種皮膚纖維化疾病，治療效果不佳，復(fù)發(fā)率較高，發(fā)病機(jī)制尚不清楚[5]。增生性瘢痕雖是一種良性皮膚腫瘤，但無自愈傾向，增生性瘢痕往往不斷侵蝕周圍正常皮膚，經(jīng)久不愈、反復(fù)感染者有癌變傾向[6]。本課題前期研究表明異澤蘭黃素能夠促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡，但對異澤蘭黃素抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制還缺乏研究，本研究構(gòu)建了PDGFβ過表達(dá)瘢痕成纖維細(xì)胞，闡明了PDGFβ在異澤蘭黃素抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖中的作用。

本研究通過CCK8檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PDGFβ能夠抑制異澤蘭黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力的抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，過表達(dá)PDGFβ能夠顯著抑制異澤蘭黃素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，提示異澤蘭黃素可能通過抑制PDGFβ的表達(dá)，調(diào)控增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡。

PDGF是由α亞基和β亞基組成的一種二聚體糖蛋白，是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分裂的細(xì)胞生長因子。PDGF尤其在血管形成和間充質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂方面發(fā)揮重要作用[7]。PDGF通過與其受體PDGFR作用，激活信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[8-9]。本課題前期研究表明，PDGF在增生性瘢痕中呈陽性表達(dá)，并且PDGFβ在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，表明PDGFβ在增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展中具有非常重要的作用[10]。ERK（extracellular regulated protein kinases），是細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，是促分裂原活化蛋白激酶MAPK家族重要成員之一[11-12]。近年來，國內(nèi)外大量研究表明，NGF、PDGF和EGF等細(xì)胞因子能夠激活ERK信號通路，調(diào)控細(xì)胞的增殖和分裂[13]。PDGF/ERK信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的一條重要通路，在腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[14]。

本研究探討了PDGFβ/ERK在異澤蘭黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用。異澤蘭黃素處理增生性瘢痕成纖維細(xì)胞后，PDGFβ、p-ERK和Bcl2的蛋白表達(dá)水平明顯增加，表明異澤蘭黃素能夠抑制PDGFβ/ERK通路，而過表達(dá)PDGFβ能夠抑制瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡，促進(jìn)p-ERK和Bcl2的蛋白表達(dá)水平，證明異澤蘭黃素是通過抑制PDGFβ/ERK通路而誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡。但異澤蘭黃素是如何影響PDGFβ的表達(dá)還需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。

綜上所述，本研究表明異澤蘭黃素通過抑制PDGFβ的表達(dá)，抑制ERK磷酸化從而抑制PDGFβ/ERK/Bcl2信號通路，繼而誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡，抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖。闡明了異澤蘭黃素介導(dǎo)PDGFβ抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，為臨床增生性瘢痕的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Chen YY，Lu YH，Ma CH，et al.A novel elastic liposome for skin delivery of papain and its application on hypertrophic scar[J].Biomed Pharmacother，2017，87：82-91.

[2]Castel N，Karian L，Datiashvili R.Revision of a hypertrophic tracheostomy scar[J].Eplasty，2016，22，16：ic49.

[3]Huang XZ，Kang LP，Gao L，et al.[Quantative analysis of eupatilin and jaceosidin in folium of Artemisia argyi from different areas in China by RP-HPLC based on ancient medicine books][J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2017，42（18）：3504-3508.

[4]李響，劉宏偉，梁杰，等.異澤蘭黃素抑制瘢痕組織成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制[J].中國老年學(xué)雜志，2017，33（22）：5495-5498.

[5]Seok J，Hong JY，Jang JH，et al.The NEEDLELESS MICROJET：a novel device for hypertrophic scar remodelling on the forehead[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2016，30（11s）：e145-e146.

[6]Fang F，Huang RL，Zheng Y，et al.Bone marrow derived mesenchymal stem cells inhibit the proliferative and profibrotic phenotype of hypertrophic scar fibroblasts and keloid fibroblasts through paracrine signaling[J].J Dermatol Sci，2016，83（2）：95-105.

[7]Osman I，Segar L.Pioglitazone，Pioglitazone， a PPARγ agonist， attenuates PDGF-induced vascular smooth muscle cellproliferation through AMPK-dependent and AMPK-independent inhibition of mTOR/p70S6K and ERK signaling[J].Biochem Pharmacol，2016，101：54-70.

[8]Sun L，Zhao R，Lan X，et al.Goniolactone C，a styryl lactone derivative，inhibits PDGF-BB-induced vascular smooth muscle cell migration andproliferation via PDGFR/ERK signaling[J].Molecules，2014，19（12）：19501-19515.

[9]Chen CY，Liu SH，Chen CY，et al.Human placenta-derived multipotent mesenchymal stromal cells involved in placental angiogenesis via the PDGF-BB and STAT3 pathways[J].Biol Reprod，2015，93（4）：103.

[10]黃如林，梁杰，吳志賢.血小板衍生生長因子在病理性瘢痕內(nèi)的表達(dá)與血管生成的關(guān)系[J].廣東醫(yī)學(xué)，2011，32（4）：457-460.

[11]Li J，Zhang M，Ma J.Myricitrin inhibits PDGF-BB-stimulated vascular smooth muscle cell proliferation and migration through suppressing PDGFRbeta/Akt/Erk signaling[J].Int J Clin Exp Med，2015，8（11）：21715-21723.

[12]Frost EE，Zhou Z，Krasnesky K，et al.Initiation of oligodendrocyte progenitor cell migration by a PDGF-A activated extracellular regulated kinase （ERK） signaling pathway[J].Neurochem Res，2009，34（1）：169-181.

[13]Zhao Y，Lv M，Lin H，et al.ROCK1 induces ERK nuclear translocation in PDGF-BB-stimulated migration of rat vascular smooth muscle cells[J].IUBMB Life，2012，64（2）：194-202.

[14]Wang Y，Liu D，Zhao H，et al.Cordyceps sinensis polysaccharide CPS-2 protects human mesangial cells from PDGF-BB-induced proliferation through the PDGF/ERK and TGF-beta1/Smad pathways[J].Mol Cell Endocrinol，2014，382（2）：979-988.

[收稿日期]2018-07-26

本文引用格式：吳志賢，李響，莫自增，等.異澤蘭黃素通過PDGFβ/ERK

信號通路抑制增生性瘢痕生長的機(jī)制探討[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（7）：44-47.